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考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度1、试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 3、标准曲线的制作试管编号 0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。4、样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。注意事项：1、 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。

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蛋白质含量测定方法比较本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高～5mg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin—酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700） 2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易Folin—酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。六、紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。下面介绍四种紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)(Q 1%浓度10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

男的说自己是brad的意思是一个简短的英文名字，布拉德。Brad代表是Brad是Bradley,也就是布雷德利的昵称,Brad作为男孩的名字发音为brad，是古英语出身，布拉德的意思是“宽，宽”。也用作Bradford和Bradley的简写形式。男孩叫这个名字较多,出自威尔士语、英语。

老朋友，你可以打开地图软件，输入这个地方的名字就会显示他的位置，谢谢。

BRADFORD.PA.是美国宾夕法尼亚州(Pennsylvania=PA)布拉德福德县简称，ZIPPO总公司所在地.供参考，谢谢。

bradford法德干扰物质有强碱，Triton-100，SDS，先想想有没有干扰物质。这个方法对不同蛋白质显色不同，建议使用阿尔法-球蛋白位标准品，减少误差。理论上说你的样品不可能比空白还干净，不知道你的空白和标准曲线是怎么建立的不好分析问题。还有就是你的比色皿洗干净了没有？bradford法不能用石英比色皿，要用玻璃的，用完后用95%乙醇清洗。

bradford pa 是美国宾夕法尼亚州布拉德福德县简称，ZIPPO总公司所在地。made in u.s.a 是美国制造。c zippo 12 中的“12”是2012年，“C”是3月份。像你这个简单的电脑刻印的图案，如果是真的话，估计也就70~100，差不多~当然也得看哪里买的了~有的地方买的贵~

11年的黑哑漆，货号是218ZL，全新的市场价200块左右。你说的那些是底刻内容。J代表10月，ZIPPO是商标，11代表2011年，BRADFORD是宾夕法尼亚州，PA是布拉德福德县的缩写，这是ZIPPO的老家，也是工厂所在地，MADE IN U.S.A美国制造。。。

C07应该是07年三月份生产。BRADFORD,PA.是是美国宾夕法尼亚州布拉德福德县简称，ZIPPO总公司所在地。 Made in USA 就不用说了吧···

90年代到2000年之间,使用的纪年是罗马数字.VII 98年. F标识月份,从A开始.2千年有两种底刻, 00跟罗马数字

BRADFORD,PA.美国制造

价格一般从高到底 6至245

Bradford法测定蛋白质浓度 （一）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋 白质溶液测定的方法. 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法）,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白 质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定 法. 考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置（uf06cmax）,由465nm变为595n m,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色. 在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比. Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1uf06dg.这是因为蛋白质与染料结合后产生 的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的 多. （2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的 大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好. 因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间. （3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不 干扰此测定法.

一般是测氮元素的含量，之前的三聚氰胺就是这样蒙混了质监局这关的，三聚氰胺氮含量超过60%

蛋白质含量测定方法比较本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高～5mg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin—酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700） 2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易Folin—酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。六、紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。下面介绍四种紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)(Q 1%浓度10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

不管选哪个，力挺这位同学！！！

是真的，放心用吧。08年以后的机都是这样了，这是zippo公司制造z的模具损坏了而造成的，现在字母D下面的那个小缺口也被很多人用来鉴别真假机。

其实这个效率基本上没法计算。因为bradford法不能检测分子量小于3000Da的样品，而蛋白本身的吸收峰也在280nm，例如胰酶本身也是蛋白，没有完全酶解的蛋白，或者是略大的肽段都在280 有吸收峰，所以用这个来体现酶解效率是不准确的。在一般情况下，大家默认酶解效率是100%，因此1g的蛋白完全酶解后应该获得1g的肽段。但是如果是第一次实验，那么首次酶解完的样品，需要先去跑一轮质谱看一下，是不是酶解完全，如果没有，再来调整酶解的条件。这样对于后续实验室是最保险的方法，否则其他方法都不可能获得准确的结果，都只是预估的。

没图说个屁啊，J ZIPPO 09 代表09年10月生产，后面就不用管了，你得有图才能知道是那款，才有价格，去ZIPPO吧，要买Z去Z吧找神兽

D 代表的是 4月 月份 按A=1 B=2 以此类推 05 是 年份 2005年4月出厂的机器 后面这些英文 没什么太大含义 因为 所有的zippo都生产于美国USA 至于其他国家(有韩版 日版 欧版 加拿大版(加版工厂已经关闭)) 也都是made in USA 只不过 做了一下外表的再加工 毛培机都是 美国原产的 材质为铜合金

只知道是06年一月份的机子，而且BRADFORD.PA中间那个不是点，是逗号，如果是点的话那是假机无疑

无图无真相

这些字母不是代表zippo的型号，而是代表他的生产年月和产地，J代表十月份，13代表2013年， bradford pa代表宾夕法尼亚州布拉德福德县，USA就不用说了吧！

我指信任百度百科

先试著用ACD打开，再另存为jpg格式

　　卫宫 士郎　　（えみや しろう，Emiya Shirou， 　　　　声优：杉山纪彰；野田顺子（幼年）/台湾：刘杰；雷碧文 （幼年）） 　　　　身高：167cm，体重：58kg 　　英灵：Saber 　　印象颜色：赤铜 　　　　擅长：修理、家庭料理 　　喜欢的东西：家庭料理 　　难对付的东西：言峰绮礼　　为穗群原学园（ほむらばら/Homurabara）高中部二年级学生，口头禅“为什么（なんでさ）”。 　　　　见习中的魔术师，10年前冬木市（Fuyuki）大火中的少数生还者之一。被身为魔术师的卫宫切嗣所救出并收养，受卫宫切嗣的影响，是个英雄迷，并发誓长大之后一定要成为“正义的伙伴”拯救所有受到苦难的人们。所以只要是他人的请求他从不会拒绝。很喜欢 saber / 塞芭，对她有特别的爱意（在前面自己一直没发现）。擅长分析物件结构和修理电器。虽然是魔术师，不过除了强化及投影以外，并不会其他的基本魔术。 　　　　士郎的自我治疗能力是来是他体内 Saber/塞芭 的鞘——“遗世独立的理想乡(Avalon)”是不和Saber连系起来就不会发现的能力。(而且说到底，只不过是御主受惠使用着只有Saber能使用的“遗世独立的理想乡(Avalon)”而已)圣杯战争中还说得过去，没有Saber的状态下，那就只是让士郎的魔术特性变成“剑”的东西而已吧。另外，应该想成圣杯战争被解体时，和Saber的联系消失，对“遗世独立的理想乡(Avalon)”的意象也一起消失了吧。 　　　　英灵化的卫宫士郎身份是Archer。天生就对剑特别喜好弓术达到大师的境界，“箭矢呢，是在射出前就已经射中了的”，因此他唯一的失误只是因为他本来就没有要让箭矢击中红心。拥有技能：投影所有理解范围内的宝具（限定剑属性）。由于本身的魔术特性是剑，虽然并非天才，亦没有卓越的才能，但是凭借着认真和不懈的努力，终于得到了与其付出的努力相对应的成绩，可以在暴走状态下瞬间读取眼里所见的每把剑宝具，并将其投影出来。因此在UBW线中与英雄王匹敌。此外固有结界-无限剑制由于与Archer的心灵状态不大相同，因此唱诵的咒文也有一些差别。 　　　　根据投影的规则，就算完美的投影出宝具，也会比原先的宝具降低一个等级（防具需要消耗2-3倍的魔力）。但是可以连同使用者的经验一同拷贝，所以只要投影出来的剑都能够立刻的上手使用，彷佛是自己曾用过的剑一样。 　　　　不可复制"Ea”、"Excalibur”这些神造兵器，能投影的武器基本上是白刃战限定，可投影剑类外的武器但是威力都无法达到宝具的地步，只有投影剑类的武器时可达到宝具的地步。　　Saber　　（セイバー，声优：川澄绫子/台湾：雷碧文/Animax粤语：郭碧珍） 　　　　身高：154cm，体重：42kg，三围：B73/W53/H76(cm) 　　印象颜色：青　 　　喜欢的东西：狮子、美食 讨厌的东西：大大咧咧的吃饭、过多装饰 　　属性：秩序·善 　　　　本作FATE线的女主角。原型是英格兰传说中的国王，圆桌骑士团的首领——亚瑟王（King Arthur）。与士郎订定契约，剑士的英灵，是个拥有一头亮丽金发与深绿眼睛的美少女。她的职阶（Saber）被誉为所有从者中最优秀的。性格忠诚老实，一本正经，不爱言谈，也很有责任感，不过有时也会显现出少女该有的样子。到后半段对主人卫宫士郎，也产生了爱情。因为主人不懂得最基本的PASS，因而无法补给魔力给她。必须自行由食物补给，通过睡眠减少魔力消耗。后由凛使用特殊仪式将士郎的魔术回路给予Saber，而由主人提供魔力回复。因为其为“未死”，不能灵体化。平时用风王结界（Barrier of the Wind King）令剑处于隐形状态（后来因使用宝具让剑现身，就再也没隐藏过）。特别喜欢狮子（因为有一段养育小狮子的经历。）。 　　真实身份是不列颠传说的英雄亚瑟王，真名为阿尔托莉雅（Altria Pendragon）的女性，拥有亚瑟王的神剑Excalibur（誓约胜利之剑）。来到现世，目的只有一个，取得圣杯并实现回去古时不列颠，并用石中剑重新选定为王。装置于士郎体内的宝具是Saber曾经遗失的剑鞘‘阿瓦隆（Avalon）"即“理想乡”，因此就算受了极近濒死状态的伤势都能够顺利的复原。是当年切嗣为了救士郎而将概念武装Avalon放在士郎体内的。在与英雄王的战斗下，使用了Avalon成功的抵挡了英雄王的EA，由于那是传说中亚瑟王死后到达的"理想乡"，因此就连五大魔法都无法对其干涉。 最后在贝狄威尔将Excalibur还给湖之仙女后赶回亚瑟王身边和亚瑟王一番对话中Saber安详的死去，之后被送去阿瓦隆。 　　　　在剧场版中曾成为远坂凛的Servant,能发挥出完全实力。在HF线中曾成为黑化状态下间桐樱的Servant，在除破坏力的各方面力量下降，圣剑也成为黑色，但破坏力达到最强，论实力也超过士郎为其Master的时候。　　远坂 凛　　（とおさか りん， Rin Toosaka， 　　声优：植田佳奈/台湾：杨凯凯/Animax粤语：吴梅） 　　身高：159cm ，体重：47kg ，三围：B77/W57/H80(cm) 　　生日：2月3日 　　血型：O型 　　印象颜色：红 　　擅长：毫无错漏的处理事情 　　喜欢的东西：宝石磨光 　　 难对付的东西：电子机器、突发性事件（小事完美、大事出关键性错误） 　　游戏中UBW（Unlimited Blade Work）线的女主角。与士郎在同一个学园（2年A组）读书的美女魔术师。为有着悠久历史的魔术名门远坂家的继承人，传说远坂家祖上的大师父是魔法师，而远坂家世代为冬木市这块土地的管理者，继承先父的遗志参加圣杯战争。在学校扮演着优等生的身份，但事实她是一名爱嘲讽和作弄别人的小恶魔型少女但同时也是一个爱照顾人的大姐姐。作为魔术师有着高强的实力，不过经常在重要的地方发生失误。 　　凛擅长的是宝石魔术，一般魔力在自己体外后容易气化难以保存，但是远坂的血统与宝石相性相当的高，每日都可以把自己多余的魔力保存，日积月累下来下的威力(跟价值)都相当可观，其中凛有十颗威力高达A+可伤害从者的宝石（HF线中，由士郎投影的宝石剑威力更大，攻击力被初步估计为小型的Excalibur，每次释放魔力量为1000左右），但是在Saber的A级对魔力下会无效化,Fate线里曾经用A+的宝石杀死Bersarker一次,威力其实很巨大，TV版中在士郎与Saber的协助下成功利用全部的宝石一次杀死了Barsarker7次。 　　由于宝石魔术是属于用完即丢的模式，花费相当的大，因此对金钱话题十分的敏感。在料理方面，至少在中华料理上比士郎要擅长。 　　在剧场版中为救士郎与Saber，曾成为Saber的主人，并在最后答应未来的士郎照顾好现在的士郎。　　间桐 樱　　（まとう さくら， Sakura Matou， 　　声优：下屋则子/台湾：林美秀/Animax粤语：潘芳芳） 　　身高：156cm ，体重：46kg ，三围：B85/W56/H87（cm） 　　生日：3月2日 　　血型：O型 印象颜色：樱花色 　　擅长：家务全能 　　喜欢的东西：甜的东西、怪谈 　　难对付的东西：体育、体重计 　　本作HF（Heavens Feel）线的女主角。间桐慎二的妹妹，比士郎低一个年级的后辈，同时是弓道社社员，对士郎而言像是妹妹一样的存在。在士郎面前总是充满笑容，对士郎抱有爱意，拥有沉稳的性格，过去经历十分阴暗，后来由于藤村大河和卫宫士郎的影响变得比较开朗，现在每日都到士郎的家准备早饭、晚饭。 　　本名是远坂樱，与凛是亲姐妹，因魔术师家族只会把魔术刻印传给其中一个继承者所继承，而间桐家同时要求过继一个拥有魔术回路的人当继承人，所以远坂樱被送到了同为魔术师家族的间桐家，改名为间桐樱，被间桐家折磨了11年，拥有与凛相当的魔术回路，在HF线中在将要黑化的状态下受到了间桐慎二的刺激将间桐慎二击杀并进入黑化状态。　　伊利雅斯菲尔·冯·爱因兹贝伦　　（イリヤスフィール·フォン·アインツベルン， Illyasviel·Von·Einzbern， 　　声优：门胁舞以/台湾：林美秀/Animax粤语：潘芳芳） 　　身高：133cm，体重：34kg，三围：B61/W47/H62(cm) 　　印象颜色：雪白、银 　　喜欢的东西：卫宫士郎 伊利雅　　爱称：伊利亚（イリヤ， Iriya），七名御主（マスター，master）之一，爱兹贝伦家为了圣杯战争而养育 　　长不大的人造人，是本次圣杯战争之中最强的御主。因为被家族当成道具，所以个性上有点扭曲，平常是坦率天真的女孩，不过也有冷酷无情的一面，是个令人联想到雪的女孩。 　　父亲是卫宫切嗣，是士郎名义上的姐姐，来日本的目的之一就是来杀死切嗣，得知切嗣死亡后便把注意力放在士郎身上，年纪比士郎大1岁。 　　本身是圣杯的容器，负责接收从者的灵魂，当容纳越多时会舍弃“不必要的人体机能”。依莉雅容量的极限是四位，到第五位就会发生作为人类的机能不全了，在圣杯战争结束后留在了士郎身边。　　间桐 慎二　　（まとう しんじ， Shinji Matou， 　　声优：神谷浩史/台湾：林谷珍） 　　身高：167cm，体重：57kg 　　印象颜色：石黄 　　间桐家长男，前任家督间桐鹤野的亲生子。间桐樱的义兄。卫宫士郎中学以来的同学，不过在上了高中之後便开始疏远。喜欢远坂凛。 　　虽然出生在魔术师的家系，母亲又是传承保菌者，慎二的身上仍然没有魔术回路，没有魔术师的才能,所以想靠圣杯成为魔术师而参加圣杯战争。因为现世跟理想的反差,所以在三年前知道樱是魔术师之后,不断凌辱她。 　　能成为ライダー（Rider）的Master是靠著樱利用间桐魔术，以一个令咒为代价制出伪臣之书转移操控权，因此ライダー（Rider）真正的主人是樱。即使是慎二在操纵ライダー（Rider），她行动时也是消耗樱的魔力；对樱来说这是很大的负担。 　　在UBW线中曾一度成为吉尔加美修的Master，之後被吉尔加美修以伊莉雅的心脏为媒介做为小圣杯；结局时被远坂凛跟士郎所救。HF线则是被将要黑化的间桐樱杀死。　　葛木 宗一郎　　（くずき そういちろう， Souichirou Kuzuki， 　　声优：中多和宏/台湾：黄天佑） 　　身高：180cm，体重：70kg 　　印象颜色：灰绿 　　穗群原学园的教师，忠诚老实沉默寡言而非常严格的人物，在学生们之中的评价其实不坏，在柳洞寺寄宿。　　是Caster的御主。过去是杀手，因为暗杀了一名政要，在冬木市隐居。 　　与其他的御主的后援相反，在Caster魔力强化下可跟从者战斗，曾有压制塞芭/Saber的纪录。没有目标，纯粹协助Caster取得圣杯。 　　动画19话中和Caster一起死在Gilgamesh发动的宝具箭雨中.剧场版则与Caster一起死在了Archer投影的宝剑雨中。　　Servant（サーヴァント）　　（アーチャー， 　　声优：诹访部顺一/台湾：黄天佑） 　　 身高：187cm， 体重：78kg 　　印象颜色：红 　　擅长：修理、家务全能 　　喜欢的东西：所有家务（本人否认） 　　难对付的东西：正义的伙伴 　　属性：中立·中庸 　　与凛订定契约弓兵的英灵。经常嘲讽他人的现实主义者，不过与凛之间互相有着坚强的羁绊。喜欢单独行动，明明是Archer却喜欢近身战和剑，拿手的武器是雌雄双剑－干将莫邪，超人的弓技直到Fate/hollow ataraxia才展现。他本人自称由于召唤时的事故忘了自己的真身为何，拿手的技术是家事全能，凛曾称赞过他泡的红茶非常好喝。 　　有【錬鉄の英雄】的别名。本次圣杯战争唯一来自未来的英灵，真名是Emiya 卫宫，是未来成熟的卫宫士郎，他战斗的一个重要目的是要杀死愚蠢地抱着不当理想的卫宫士郎。 　　具有魔术师的能力也是他象征性的宝具“固有结界（Bounded Field）”Unlimited Blade Works（无限剑制），游戏中曾经击杀狂战士（Berserker）6次，动画中击杀Berserker5次。 　　在TV版中与Berserker战斗，击杀Berserker5次后，力尽而亡。剧场版在士郎发现自己真实身份后与士郎进行交战，本该消失的他最终在凛前去救慎二遇到困难的时候帮助了凛，在英雄王妄图逃脱圣杯的吞噬之时将英雄王打回了黑圣杯所产生的黑洞。 　　在与Berserker的战斗之中曾和伊莉雅说过：“伊莉雅，你嘴上还是不饶人呢。”表明自己是卫宫士郎，但是无法被伊莉雅理解。在剧场版的最后向凛露出了自己的本来面目。　　Berserker　　（バーサーカー， 　　声优：西前忠久/台湾：黄天佑/Animax粤语：卢雄） 　　身高：253cm，体重：311kg Berserker　　印象颜色：铅色 　　擅长：因为狂化而没有 　　喜欢的东西、难对付的东西：因为狂化而没有 　　属性：混沌·狂 　　狂战士的英灵。其正体是海格力斯（Hercules，或译为赫拉克勒斯、赫丘力士），是希腊神话中最伟大的英雄，身高高达253cm，宝具“十二的试练（God Hand）”，B以下的攻击无效化，多么高纯度的攻击只要对Berserker使用过一次就不再有用。拥有十二次生命。拥有所有从者中最优秀的战斗能力,可惜因为狂化的效果,令他不能使出宝具 射杀百头（HF线中，卫宫士郎使用过）。海格力斯是这次爱兹贝伦家犯规召唤来的从者，以牺牲理性的方式换取压倒性的破坏力。 　　动画中被士郎和Saber联合一击击杀(武器为士郎投影出来的Saber的"胜利之剑") 　　剧场版(凛线)被英雄王，即吉尔伽美什，的天之锁封锁行动后，被王之财宝所打败。　　Lancer　　（ランサー， 　　声优：神奈延年/台湾：林谷珍） 　　身高：185cm，体重：70kg　　印象颜色：青 　　擅长：钓鱼、潜入、登山 　　喜欢的东西：气势强的女人、无理的约定（约束） 　　难对付的东西：不直接的方针，背叛 　　属性：秩序·中庸 　　枪骑兵的英灵。个性自我、豪放不羁，重视约定胜于性命。持有对人宝具“刺穿死棘之枪（Gae Bolg）”，号称必中心脏的魔枪，另一招为“穿刺死翔之枪”，乃威力极大的对军宝具。真身为爱尔兰神话英雄库丘林（Cu Chulainn，又译库夫林）。一开始为了杀人灭口而追逐撞见自己与Archer之间战斗的士郎，反而促使士郎在情急之下召唤出Saber，喜欢单独行动与痛快淋漓的战斗，侦查任务是在Master命令下不得不为的工作。本性善良，在FATE线曾帮助Saber对抗英雄王吉尔伽美什，最终被英雄王打败.在剧场版中被言峰绮礼使用令咒自杀,但在死亡前击杀了言峰绮礼并打伤间桐慎二.在UBW线保护了凛。同时在UBW线可以看出，Lancer十分的欣赏凛。　　Rider　　（ライダー， 　　声优：浅川悠/台湾：钱欣郁/Animax粤语：潘芳芳） 　　身高：172cm，体重：57kg，三围：B88/W56/H84（cm） 　　生日:2月2日 　　印象颜色：暗紫 　　擅长：骑马、惊险的杂技、尾随　　喜欢的东西：酒、读书、蛇 　　难对付的东西：镜子、身高测定 　　属性：混沌·善 　　骑士的英灵。因此擅长在特殊地形（如高空）战斗。Rider这个职阶同时必需拥有强力宝具才能担任，使用可隐形的锁链刃作为武器。FATE线被Saber所杀，Heaven Feel线True Ending与远坂姐妹和卫宫士郎一起生活。凛线中推测被葛木所打败。 　　身分为希腊神话中的女妖美杜莎（Medusa，又译梅杜莎）。如同此名有着驾驭传说中天马的骑乘能力，具有极高的机动性，持有宝具为“自我封印·暗黑神殿（Breaker Gorgon）”、“他者封印·鲜血神殿（Blood Fort Andromeda）”与“骑英之缰绳（Bellerophon）”，也拥有特殊技能石化魔眼（Cybele）。原为间桐樱的从者，但在间桐脏现（Zoken Matou，间桐慎二之祖父）的命令下将令咒转让予间桐慎二。　　Caster　　（キャスター， 　　声优：田中敦子/台湾：林美秀） 　　身高：163cm 体重：51kg 三围：B82/W57/H84（cm） 　　 印象颜色：紫黑 　　擅长：奸计、模型制作 　　喜欢的东西：沉默诚实的人、可爱的衣服和少女 　　难对付的东西：肌肉 　　属性：中立·恶 　　魔术师的英灵，能够使用自神话时代以后就不存在的高等魔术。并以柳洞寺当作根据地，擅长策略。 　　真实身份为美狄亚（メディア/Medea），在希腊神话中是以背叛和欺骗闻名的女神，宝具是“破尽万法之符（Rule Breaker）”，用来破除任何契约能力。因自身也是魔术师的关系所以能召唤从者，因此她利用了这个规则漏洞召唤了Assassin。 　　用计杀死前主人后，被葛木宗一郎捡到，与葛木订下契约（非正式御主）。 对葛木产生感情. 　　在动画19话中妄图让Saber成为自己的仆人,并因此死在了为此现身的Gilgamesh的宝具箭阵中,本可逃走但为保护葛木身中数击而阵亡. 　　在剧场版中与葛木死在了Archer投影的无数宝剑之下。　　Assassin　　（アサシン， 　　声优：三木真一郎/台湾：吴文民） 　　身高：176cm 体重：63kg　　印象颜色：群青 　　擅长：剑 　　喜欢的东西：花、鸟、风、月 　　难对付的东西：没有特别难对付的、HA（Fatehollow ataraxia）中为三枝由纪香 　　属性：中立·恶 　　暗杀者的英灵，有“气配遮断（Presence Concealment）”这样能偷偷靠近暗杀对象的特殊技能。 但由于原型不是正统Assassin,此能力强度只有D级（真·Assassin哈桑·萨巴赫的此能力为Assassin所持有的真正等级：A+）。 　　本身是一位架空英灵，只存于日本的故事或神话中。佐佐木小次郎对圣杯没兴趣，只是想与强者过招。没有任何宝具，但凭着一己之力练出了“燕返”（Swallow Reversal,同一时间和对手斩出三刀），有着魔法级的效果。单论剑技的话是众从者中最强的，连Saber也未必是其对手。 　　由Caster利用自身也是魔术师的规则漏洞召唤订定契约，只拥有生存二十天的灵力，而且不能离开柳洞寺的大门，只能充当守门人。 　　在动画19话中,与Saber对决，最终被打败。 　　.　　Gilgamesh　　（ギルガメッシュ， 　　声优：关智一/台湾：吴文民） 　　身高：182cm 体重：63kg　　印象颜色：金 　　擅长：永远不缺钱花 　　喜欢的东西：自己、权力、收藏各种宝具的原型 　　难对付的东西：自己、蛇 　　属性：混沌·善 　　本作幻之第八名从者，前回（第4次）圣杯战争中与Saber留到最后的英灵，最后Saber也没办法得知他的身分，因为找不到他象征性的宝具。曾在前次对决时向Saber表白但失败。也出现在动画剧情中。个性超级自大，完全的自我中心，但本人自称“不骄傲的哪算是王！”。喜欢称呼他人为“杂种”。 　　真名为英雄王“吉尔加美什”（（ギルガメッシュ， Gilgamesh）），为苏美尔传说中乌鲁克的国王。宝具是王之财宝（Gate of Babylon），是开启巴比伦之门的锁匙，内部收集全世界宝具的原型，正确用法是针对英灵传说中的弱点，选择正确宝具作出攻击，但由于时间久远加之宝具众多，慢慢忘记了各种宝具的特殊功用，最后沦为将无数的珍贵兵器当成箭射出。宝具“天之锁（Chain of Heaven）”神性愈高就会锁得愈紧(在UBW线中对Berserker用过),还拥有唯一的对界宝具─“开天辟地·创世之星”（Enuma Elish，名称源自于巴比伦古代史诗）。但凭其宝具质量、数量，实力远超过其它Servent，Saber亦无法与之对敌。只有游戏版完成了固有结界的士郎可以一决高下。 　　由于将宝具作为弓矢使用的方法，因此在第四次圣杯战争职阶为Archer。 　　除了他大概没有其他英灵可以抵抗圣杯的黑色物质,作为半神的存在，他被誉为三分之二的神性，三分之一的人性在TV版中被取回剑鞘的Saber打败.因为过于自傲，在剧场版中被使用了无限剑制进入暴走状态的士郎模仿了自己所用过的剑宝具而被击败。　　真·Assassin　　原名 哈桑·萨巴赫 　　起源于中东的暗杀教团首领。　　有一个流派成为了Assassin这一单词之语源，而他正是其传说中的头目，别号“山中老人”。使他们过激到如此地步的始作俑者，正是山中老人哈桑·萨巴赫。 他占据了山中之城，将那里作为据点，组建将他的方针贯彻始终的教团组织。 他们的存在被人在长久的岁月中夸张，最后成为了不逊色于神话英雄的幻想而扎根于现代人心中。在很多个故事中都有出现的山中老人哈桑·萨巴赫，是隐藏本来面目的Assassin高级干部。据说成为教团的首领之人都要使用这个名字，并模仿他的姿态。不，想必是非得如此不可。 在本故事的圣杯战争中，Servant中的Assassin全都是从“山中老人”之中召唤出来的。 每次换代都会诞生一个哈桑·萨巴赫。而那几十个首领的其中一个，便以哈桑的身份被召唤到现代。 ……在被人称为Assassin之前的名字，在成为暗杀者之前的那真正的形象与名字都早已失却。　　老一辈人物　　言峰 绮礼（ことみね きれい， Kirei Kotomine， 声优：中田让治/台湾：林谷珍） 　　身高：193cm 体重：82kg 生日：12月28日 　　血型：B 　　印象颜色：有紫色光晕的黑色 　　此次的圣杯战争担任监督的神父，有着言行复杂常人不能理解的地方。曾参加上次（第4次）的圣杯战争。远坂凛在魔术方面的师兄，热爱吃麻婆豆腐。 　　事实上在第五次圣杯战争中，他是游戏的最大作弊者，控制了Lancer和Gilgamesh两个从者，对士郎来说是相当于“绝对恶”的存在。 　　上一次圣杯战争被切嗣射杀，因为圣杯流出的黑色物质无法污染Gilgamesh而逆流回御主身上，填补了他被射穿的心脏。Fate/Zero中他原是埋葬机关代行者的候补。 　　在TV版中死在了凛送给士郎的匕首下(AZOTH剑最初是远坂凛父亲，远坂时臣送给弟子——言峰绮礼的，岂料被他用此剑所杀，而言峰绮礼将此剑赠与远坂凛也是出于恶趣味。),剧场版中死在了被自己使用令咒被迫自杀的Lancer手中。 　　　　卫宫 切嗣（えみや　きりつぐ， Kiritsugu Emiya， 声优：小山力也/台湾：林谷珍） 　　卫宫士郎已故的养父，由于脱出被污染的圣杯，魔术回路被掠夺八成，身体机能衰弱，于五年前去世，享年三十四岁。第4次圣杯战争的参加者，绰号是“ 魔术师杀手”，是 塞芭/Saber的前任御主，代表爱因兹贝伦一族出战，冷酷无情，对目标贯彻到底毫不留情，然而却命令 塞芭/ Saber破坏了即将得到的圣杯，拥有“固有时间制御”可以将自身的时间速度做加速或减缓。与士郎共同生活后变成了好父亲，与藤村好像也很亲近。　　普通配角　　藤村 大河（ふじむら たいが， Taiga Fujimura， 声优：伊藤美纪/台湾：钱欣郁） 　　身高：168cm，体重：53kg 　　印象颜色：黄（老虎斑纹） 　　穗群原学园的教师，是士郎的班导，昵称“藤姐”。同时是弓道部顾问，剑道5段。非常讨厌被称为“老虎”（tiger），被这样叫的话会非常生气。但是身上带着竹剑加上虎纹的皮带常被认为是虎迷。父亲是黑道老大，家里很有钱，不过还是经常去卫宫士郎家白吃白喝，是个天真率直的人。 　　　　美缀 绫子（みつづり あやこ， Ayako Mitsuzuri， 声优：水泽史绘/台湾：雷碧文） 　　身高：162cm 体重：50kg 三围：B83/W58/H83(cm) 　　士郎的同学，担任弓道部的社长，个性豪爽直快，不论在男女之间皆受欢迎，是远坂凛的少数朋友之一。曾被Rider吸过灵力，因而对其有恐惧感。 　　　　柳洞 一成（りゅうどう いっせい， Issei Ryudou， 声优：真殿光昭/台湾：黄天佑） 　　身高：170cm 体重：58kg 　　印象颜色：透明 　　与士郎同年级的学生会长，也是士郎的朋友，忠诚老实认真的好青年。身为柳洞家的长子，是柳洞寺的继承人，具有看穿远坂凛的本质的尖锐洞察力。视葛木宗一郎为兄长，学生会会长。

你是说optimistic吧?如果嫌长了可以自己选择删掉一段Manypeoplearepursuinghappiness,howevertheyhavetheirownunderstandingofhappiness,andwaystogetit.Ithinkthatinsteadofsuccessoreliminationofappetite,anoptimisticmindisthekeytohappiness.Therearemanysuccessfulpeopleintheworld,howevernotallofthemarehappy.Forexample,asagoodleaderasSteveJobsis,allnewsabouthimtalkabouthowheoperatedtheApple,howhedealtwithcompetitionswithSamsungandGoogle,andhowherefusedtorecognizehisfatherandchildren.Thereisneveranysayingthathelivedhappily.Therefore,successdoesn"talwaysresultinhappiness.Somepeoplearguethatsadnesscomesfromappetite.Howeverwhenyougetridofsadnessbyhavingnoappetite,youalsorefuseallhappiness.Forexample,themonksnevercry,howevertheyseldomlaugh,either.Theinnerpeacetheyhaveisalsoagainsthappiness.Anoptimisticattitude,however,canleadustohappiness.Itisverylikelythatwemeetalotofhappyandsadthings.Nevertheless,anoptimisticpersonwillalwayshavehopeinlifeandnevergiveup.Effectofallbadthingstheymeetwillbeshrinked,whileallhappinesswillbeenlarged.Forexample,whentheyfailinsomething,theywon"tlosetheirheartastheyknowthereisstillhopeinthefutureandnofailureisintolerable.Onthecontrary,whentheyhavesuccess,orhearajoke,theywillbeveryhappy.Inthisway,happinesswilldominatetheirlife.Thusoptimisticmindwillleadtohappiness.Insummary,itistheoptimisticattitudeinsteadofotherthingslikesuccessoreliminationofappetitethatcanleadtohappiness.

破灯前面那段是是FATE OST里面的第37首,名字是Tenchi Hou Take 破灯以后那段是FATE OST里面第23首,名字是Emiya -Kenji Kawai ver你要下后面一首直接在BAIDU MP3里搜索Emiya就可以了

Moderate exercise can help digestion and appetite.

红a和卫宫士郎是一个人。他的真身是“卫宫[Emiya]”。即是在未来为了拯救五百名人类而祈求奇迹，作为代价而英灵化的卫宫士郎。虽是无名的英灵，却把士郎所持的固有结界“无限剑制(Unlimited Blade Works)”锻炼、操纵至极限，跟在场的英灵们势均力敌。作为英灵的他处于“守护者”的立场，拥有以虐杀人类来回避灭亡的职责。屈服于不断重覆的杀人以及人类所展示出的丑陋，对杀死士郎以消灭自身产生了希望。可是他无论在哪条路线，结果都选择为了守护他人而战。他的天性，似乎死了也没有治好。成为英灵卫宫死后如契约所言成为了英灵。纵然因背叛而迎来死亡但他却没有憎恨人类，但讽刺地“世界”给予作为英灵的他的职位就是，“在人类引起自灭时现界、残杀该处的所有人类”的“守护者” 。由于不是和其他英灵一样出自典故，不能被称为正统的英灵，该英灵被称为守护者，是由认为人类“应当延续”的集体无意识所产生的防卫装置般的存在。这种防御装置也被称为灵长类的抑止力，要点在于要选择没有名字的人们，没有知名度的正义代理人。

poor appetite 不思饮食 英汉中医药学名词poor appetite 纳谷不香缺乏食欲，饮食无味的表现。

　　11. affection for/towards 爱,喜欢，如： 　　Yearby year their affection for each other grew stronger. 　　他们相爱逐年加深. 　　He felt great affection for his sister. 　　他很疼他的妹妹. 　　12. answer to u2026u2026的答案，如： 　　The answer to his problem was staring him in the face. 　　他那个问题的答案是明摆著的。 　　Do you know the answer to this question? 　　你知道这道题的答案吗? 　　13. anxiety for sth 渴望，如： 　　His anxiety for knowledge is to be praised. 　　他对知识的渴应该受到称赞。 　　14. apology to sb for sth 道歉，如： 　　He made an apology to me for hurting my feelings. 　　他因伤害了我的感情而向我道歉。 　　At last we convicted him of his errors and made him offer an apology to her. 　　我们终于使他认识到自己的过失而且还让他身她道了歉。 　　15. appeal to sb for sth 恳求,呼吁，如： 　　The company is prepared to trade off its up-market image against a stronger appeal to teenage buyers. 　　该公司拟改变只售高档商品的形像, 以吸引青少年顾客. 　　His lawyer decided to take an appeal to a higher court. 　　他的律师决定向高一级法院上诉。 　　16. appeal for 魅力,吸引力，如： 　　Does jazz hold any appeal for you? 　　你对爵士乐有兴趣吗? 　　The radio operator sent (out) an appeal for help to headquarters. 　　无线电报务员向司令部发出求救信号. 　　17. appetite for 对u2026u2026的欲望，如： 　　Reading travel brochures whets oneu2019s appetite for a holiday. 　　看了旅游手册就巴不得去度假. 　　Why donu2019t you go for a walk? Itu2019ll give you an appetite for your lunch. 　　你怎麽不出去散散步? 散散步午饭时就有食欲了. 　　18. application of 把u2026u2026应用于u2026u2026 如： 　　application of microwave energy 　　微波能应用 　　application of computers in chemistry 　　计算机在化学中的应用 　　19. approach to 类似,办法,通道，如： 　　Her approach to the job lacks purpose. 　　她干这项工作缺乏毅力. 　　She is extremely professional in her approach to her job. 　　她对工作极为精通. 　　20. argument against 赞成/反对u2026u2026的理由，如： 　　There are strong arguments against these measures. 　　有一些有力的论据反对这些措施。

卫宫士郎在未来成为英灵后的姿态。经历过圣杯战争后戆直地锻炼自己、追逐著成为“正义伙伴”的梦想的他，不久就陷入仅以自己的力量不足以拯救人类的绝望状况。Emiya在濒死的人们面前与“世界”契约、成为了唤起奇迹的英雄，但却因同伴的背叛而悲惨地丧命。纵然因背叛而迎来死亡但他却没有憎恨人类，但讽刺地“世界”给予作为英灵的他的职位就是，“在人类引起自灭时现界、残杀该处的所有人类”的“守护者”。

I want to eat nothing this morning.

1、cooked，读音：美/ku028akt/。 2、释义：v.烹饪；被烧煮；篡改；伪造；（非正式）干得起劲，干得好（cook的过去式及过去分词）。adj.煮熟的。 3、例句：The cooked vegetables were wasted.这些煮好的蔬菜被浪费掉了。

cooking

不知楼主玩过游戏没？网上有种说法（个人也比较赞同）是游戏的HF线里badend30：士郎得知樱的真相后决定成为正义之士而非保护樱，结果为了自己的信念牺牲了心爱的人。在任凛杀死樱后，决定以心为剑，成为正义之士（红A）。然后就有了archer大战berserker时所说的：“我以为自己已经了却私情了。”

i can hardly eat anything

dng战队在日本是一支非常具有实力的队伍。在春季赛决赛憾负pgm之后，夏季赛dng不仅拿下常规赛第一名，在季后赛中也打出了统治力，成功拿下冠军。

做饭

Good appetite for dinner.的意思是祝你胃口好.另一种常见的说法是Bon appetit. 所以最简单的回答就是： Thank you!

两者比较的是字母o的发音，它们的发音是不相同的

圣杯被毁，Saber消失，吉尔美伽什被主角灭了。

dng是公共存档格式文件。dng格式是数码相机原始数据的公共存档格式，可以用Adobe DNG等版本的软件打开。它是数码相机原始数据的公共存档格式。DNG解决了不同型号相机的原始数据文件之间缺乏开放式标准的问题，从而有助于确保摄影师们将来能够访问他们的文件。dng格式，是一种用于数码相机生成的原始数据文件的公共存档格式。它的全称叫做Digital Negative。它能更好的使文件得到保存，同时也能更好的提高工作效率。dng格式出现的原因因为不同厂商和型号的相机有不同的原始数据文件格式，而不同格式之间无法读取。而dng格式作为一种单一的原始数据处理解决方案，是一个公开并且可以随时获取的存档规范，从而有助于摄影师们将来能够访问他们的文件，能够提高工作流程的效率。更容易被相机厂商所采用，而且更易于更新，以适应未来技术的改变。

1、dng格式是数码相机原始数据的公共存档格式，可以用AdobeDNG等版本的软件打开。它是数码相机原始数据的公共存档格式。2、在数字摄影工作流程中，原始数据文件格式日渐风行，并正在成为一种时尚，因为它为图像制作专业人士提供了更大的创意掌控空间。然而，相机能使用多种不同的原始数据格式，而这些格式的规范不能公开获取。这意味着并不是每一种原始数据文件都能被众多软件应用程序所读取。因此，采用这些专有的原始数据文件作为长期存档的解决方案问，存在着一定答风险，而要在多个复杂的工作流程中共享这些文件，则更富挑战性。更多关于dng格式怎么打开，进入：https://www.abcgonglue.com/ask/e23c081616097795.html?zd查看更多内容

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