底座写的是 A ZIPPO 06 BRADFORD.PA.MADE IN U.S.A.

考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度1、试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 3、标准曲线的制作试管编号 0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色 A595nm 以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。4、样品中蛋白质含量的测定 另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。注意事项：1、 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。2、 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。

有统一的标准曲线 现在有些先进的设备里面是有输入好的BF的标准曲线 只要你把样品处理好直接读取就可以了 比如GE的Nanovue 如果你只有分光光度计 那只能自己做标准曲线了 因为标准曲线需要和样品平行进行BF反应,不然结果会有较大误差

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蛋白质含量测定方法比较本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高～5mg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin—酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700） 2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易Folin—酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。六、紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。下面介绍四种紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)(Q 1%浓度10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

男的说自己是brad的意思是一个简短的英文名字，布拉德。Brad代表是Brad是Bradley,也就是布雷德利的昵称,Brad作为男孩的名字发音为brad，是古英语出身，布拉德的意思是“宽，宽”。也用作Bradford和Bradley的简写形式。男孩叫这个名字较多,出自威尔士语、英语。

老朋友，你可以打开地图软件，输入这个地方的名字就会显示他的位置，谢谢。

BRADFORD.PA.是美国宾夕法尼亚州(Pennsylvania=PA)布拉德福德县简称，ZIPPO总公司所在地.供参考，谢谢。

bradford法德干扰物质有强碱，Triton-100，SDS，先想想有没有干扰物质。这个方法对不同蛋白质显色不同，建议使用阿尔法-球蛋白位标准品，减少误差。理论上说你的样品不可能比空白还干净，不知道你的空白和标准曲线是怎么建立的不好分析问题。还有就是你的比色皿洗干净了没有？bradford法不能用石英比色皿，要用玻璃的，用完后用95%乙醇清洗。

bradford pa 是美国宾夕法尼亚州布拉德福德县简称，ZIPPO总公司所在地。made in u.s.a 是美国制造。c zippo 12 中的“12”是2012年，“C”是3月份。像你这个简单的电脑刻印的图案，如果是真的话，估计也就70~100，差不多~当然也得看哪里买的了~有的地方买的贵~

c07代表生产年月，C代表月份表示3月份；07很好理解，是2007年。bradfordpa是 宾夕法尼亚（州），是原产地。 made in usa 这个应该知道吧，美国制造。字母A B C D。。。以此类推就是：一月份 二月份 三月份。。。

11年的黑哑漆，货号是218ZL，全新的市场价200块左右。你说的那些是底刻内容。J代表10月，ZIPPO是商标，11代表2011年，BRADFORD是宾夕法尼亚州，PA是布拉德福德县的缩写，这是ZIPPO的老家，也是工厂所在地，MADE IN U.S.A美国制造。。。

C07应该是07年三月份生产。BRADFORD,PA.是是美国宾夕法尼亚州布拉德福德县简称，ZIPPO总公司所在地。 Made in USA 就不用说了吧···

90年代到2000年之间,使用的纪年是罗马数字.VII 98年. F标识月份,从A开始.2千年有两种底刻, 00跟罗马数字

BRADFORD,PA.美国制造

价格一般从高到底 6至245

Bradford法测定蛋白质浓度 （一）实验原理 双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋 白质溶液测定的方法. 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法）,是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白 质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定 法. 考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置（uf06cmax）,由465nm变为595n m,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色. 在595nm下测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比. Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1uf06dg.这是因为蛋白质与染料结合后产生 的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的 多. （2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的 大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好. 因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间. （3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不 干扰此测定法.

一般是测氮元素的含量，之前的三聚氰胺就是这样蒙混了质监局这关的，三聚氰胺氮含量超过60%

蛋白质含量测定方法比较本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl法） 灵敏度低，适用于0.2~ 1.0mg氮，误差为 ±2％ 费时 8～10小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低1～20mg 中速 20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50～100mg 快速 5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高～5mg 慢速 40～60分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高1～5mg 快速5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化 二、双缩脲法（Biuret法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。三、Folin—酚试剂法（Lowry法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。（B） 0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin—酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700） 2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。四、改良的简易Folin—酚试剂法（一）试剂1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。3. 标准蛋白质溶液：同基本法。（二）操作步骤测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值。改良的快速简易法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。六、紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。下面介绍四种紫外吸收法：1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。蛋白质浓度 = (A280′10 )/ A1％1cm,280nm (mg/ml)(Q 1%浓度10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： A1％1cm=6.3 (280nm)溶菌酶 ： A1％1cm=22.8 (280nm)若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试剂：管号 1 2 3 4 5 6 BSA（1.0mg/ml） 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 A280 用第1管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标，各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线，利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值，即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的蛋白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的。3. 215nm与225nm的吸收差法蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质，配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值，并计算出吸收差：吸收差D= A215 －A225以吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内，蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液，都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大，必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。4. 肽键测定法蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液，测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位。本方法比280nm吸收法灵敏。但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。

不管选哪个，力挺这位同学！！！

是真的，放心用吧。08年以后的机都是这样了，这是zippo公司制造z的模具损坏了而造成的，现在字母D下面的那个小缺口也被很多人用来鉴别真假机。

其实这个效率基本上没法计算。因为bradford法不能检测分子量小于3000Da的样品，而蛋白本身的吸收峰也在280nm，例如胰酶本身也是蛋白，没有完全酶解的蛋白，或者是略大的肽段都在280 有吸收峰，所以用这个来体现酶解效率是不准确的。在一般情况下，大家默认酶解效率是100%，因此1g的蛋白完全酶解后应该获得1g的肽段。但是如果是第一次实验，那么首次酶解完的样品，需要先去跑一轮质谱看一下，是不是酶解完全，如果没有，再来调整酶解的条件。这样对于后续实验室是最保险的方法，否则其他方法都不可能获得准确的结果，都只是预估的。

没图说个屁啊，J ZIPPO 09 代表09年10月生产，后面就不用管了，你得有图才能知道是那款，才有价格，去ZIPPO吧，要买Z去Z吧找神兽

D 代表的是 4月 月份 按A=1 B=2 以此类推 05 是 年份 2005年4月出厂的机器 后面这些英文 没什么太大含义 因为 所有的zippo都生产于美国USA 至于其他国家(有韩版 日版 欧版 加拿大版(加版工厂已经关闭)) 也都是made in USA 只不过 做了一下外表的再加工 毛培机都是 美国原产的 材质为铜合金

无图无真相

这些字母不是代表zippo的型号，而是代表他的生产年月和产地，J代表十月份，13代表2013年， bradford pa代表宾夕法尼亚州布拉德福德县，USA就不用说了吧！

我指信任百度百科

过去式cooked现在分词cooking

煮熟的

cook的过去式是cooked。cook的基本意思是烹调，煮，烧做饭菜，泛指通过加热把食物做熟。引申可指筹划，篡改等。也可表示某事在筹划中或经筹划而发生，此时常用于进行时。 cook的过去式例句： 1、Drain the pasta as soon as it is cooked. 意大利面煮熟以后立即将水沥干。 2、Most of the food is cooked on a large wood-fired oven. 大部分食物都是在一口很大的烧柴土灶上烹煮的。 3、Food that is insufficiently cooked can lead to food poisoning. 没有煮熟的食物可能导致食物中毒。

在意大利，法国都卖的很好，只是国内没有，有的话也是走私的，价格一包在50到60之间。

当然是海盗的意思名词

苹果手机不能打开dng格式。dng格式是一种用于数码相机生成的原始数据文件的公共存档格式。可以用光影魔术手、Adobe DNG Converter、Photoshop Elements、Adobe Photoshop Lightroom、adobe camera raw软件打开。因此，苹果手机不能打开dng格式。

1、意思不同述求：某商品或服务在广告中所强调的、企图劝服或打动广告对象的传达重点。诉求：指的是陈诉和请求，也指追求、要求。2、作用不同广告通过媒介向目标受众诉说，以求达到所期望的反应。诉求是制定某种道德、动机、认同，或是说服受众应该去做某件事的理由。在品牌营销体系中，述求占有重要地位。一句好的述求往往让消费者对一个品牌产生深刻印象，促进其购买，形成良好传播，积淀无形的品牌价值；反之，一个没有良好述求的品牌则像一个没有一双美丽眼睛的姑娘，纵然漂亮但总是缺少些灵气。因此，长期以来，无论是什么行业的企业，大多都对述求非常看重。3、分类不同诉求分三类：理性的、感性的和道义的。诉求所用语句应具有强烈的感染力。诉以愿望或需要，以博取受众关心或共鸣，最终达到诱致受众购物的目的。述求一般分为感性述求（Emotional Appeals）和理性述求（Rational Appeals）。感性述求：采用感性说服方法的广告形式，又称情感述求。它通过述求消费者的感情或情绪来达到宣传商品和促进销售的目的，也可以叫作兴趣广告或诱导性广告。感性述求的广告不作功能、价格等理性化指标的介绍，而是把商品的特点、能给消费者提供的利益点，用富有情感的语言、画面、音乐等手段表现出来。“威力洗衣机，献给母亲的爱”就属此类述求方式。通常感性述求广告所介绍的产品或企业都是以感觉、知觉、表象等感性认识为基础，是消费者可以直接感知的或是经过长期的广告宣传，消费者已经熟知的。采用感性述求，最好的办法就是营造消费者使用该商品后的欢乐气氛，使消费者在感情获得满足的过程中接受广告信息，保持对该商品的好感，最终能够采取购买行为。理性述求：采用理性说服方法的广告形式，通过述求消费者的理智来传达广告内容，从而达到促进销售的目的，也称说明性广告。这种广告说理性强，常常利用可靠的论证数据揭示商品的特点，以获得消费者理性的承认。它既能给消费者传授一定的商品知识，提高其判断商品的能力，又会激起消费者对产品的兴趣，从而提高广告活动的经济效益。通常的理性述求广告有承诺广告、旁证广告、防伪广告、比较性广告等等。参考资料：百度百科-诉求参考资料：百度百科-述求

是D&G吧是一个国际品牌咯，很出名意大利的

开挂

appeals courts 专有名词 或者叫集合名词

拖到电脑里来不要转换格式，直接用adobe photoshop打开就可以了。 数字负片 (DNG) 是一种用于数码相机生成的原始数据文件的公共存档格式。DNG 解决了不同型号相机的原始数据文件之间缺乏开放式标准的问题, 从而有助于确保摄影师们将来能够访问他们的文件。 除了数字负片规范外, Adobe 还提供免费的 Adobe DNG Converter (Windows?* Macintosh*), 该软件能轻松转换源自当今众多流行相机的原始数据文件。当前的 DNG Converter 4.3.1 可作为基于英特尔的 Macintosh 计算机的一个通用二进制应用程序。 软件开发人员和厂商可以下载完整的 DNG 规范 (PDF, 300K)。Adobe Photoshop CS2、Photoshop CS、Photoshop Elements 3.0、Photoshop Elements 4.0 和 Photoshop Elements 5.0 、Photo shop CS5.软件都支持 DNG

cook接双宾语的用法是：cook sb sth或cook sth for sb① He cooked me my dinner. 他给我做了饭。② I like to cook Chinese dishes for my family. 我喜欢给家里人做中国菜。

圣杯战争的七个职业：一、剑士剑士，正规七职阶之一，三骑士职阶之一。符合条件的英雄本身有与刀剑相关的事迹，或者传说中宝剑的持有者，最低限度是【以剑做武器】的英雄，亦被要求魔力以外的能力值皆为最高等级。职阶技能是【对魔力】和【骑乘】。另外，符合的英灵大多有着瞬间攻击力优秀的特长。二、枪兵枪兵，正规七职阶之一，三骑士职阶之一。苛刻的合适条件仅次于Saber。全体能力值优秀，并且敏捷必须要高。理所当然，要擅长发挥枪击范围和速度的一击脱离战法。包括很多出身骑士的英灵，职阶技能是【对魔力】。三、弓手弓手，三骑士职阶之一。正规七职阶之一，以远距离攻击为特长的职阶，条件并非能力值的高低，而是具有强力射击类型武器，或者与射击武器有关联的特殊能力。作为侦察兵的素质也很高，除拥有作为骑士的【对魔力】之外，还有【单独行动】的职阶技能。四、骑兵骑兵，正规七职阶之一。具有与某个乘坐物(不只限于生物)有渊源的传说的英灵适合此职阶。有能力值比三骑士低的倾向，不过这能以传说中描述的坐骑的性能补救。职阶技能除了【对魔力】外，还拥有非常高等级的【骑乘】。五、魔术师魔术师，正规七职阶之一。合适条件也只有魔术的能力参数达至最高等级。七个职阶中专长于使用强大魔术的职阶，通常由精通魔术的英灵来担任，符合的英灵的战斗能力都较低。而且由于大部分都具备对魔力的职阶技能，所以被评价为最弱的职阶。职阶技能是【道具作成】和【阵地建造】。六、暗匿者暗匿者正规七职阶之一。是专长于隐密行动与暗杀技巧的职阶。在冬木市的圣杯战争中，符合的英灵只有历代的哈桑·萨巴赫，会召唤出其中的某个；在其他城市则不一定。全体成员均没有作为英雄的辉煌传说，因此能力值低下。拥有【气息遮断】作为职阶技能，活用此能力的战斗方式将会成为救生索。七、狂战士《Fate》系列中对作为从者的英灵进行定位而使用的用语，正规七职阶之一。曾在战斗中疯狂的英雄适合此职阶。通常Servant能够发挥原始英灵的性能就是理想的状态。但是“狂化”会以剥夺理性为交换，由于狂化增加了魔力消耗量，另外，Berserker会因为狂化影响宝具的性能，自身原有的技能也可能失去效果。而且Berserker死前狂化会消失，理性会恢复。

----------I am the bone of my sword.----------吾身为剑所成。----------Steel is my body,and fire is my blood.----------血潮为铁，心为琉璃。----------I have created over a thousand blades.----------跨越无数战场，立于不败之地。----------Unknown to Death.----------未曾败退。----------Nor known to Life.----------无一知己。----------Have withstood pain to create many weapon.----------他，常独自一人立于剑丘之上，陶醉于胜利之中。----------Yet,those hands will never hold anything.----------因此，他的生涯已经失去了意义。----------So as I pray,unlimited blade works！----------此身，已成无限之剑！英灵EMIYA是黑暗路线中卫宫士郎的未来。失去一臂，接上EMIYA的一臂。再次成为EMIYA。这就是卫宫士郎本身的轮回。继承卫宫切嗣的理想！并把它投影到现实之中！-----我要成为正义的使者。-----我要帮助一切要帮助的人~~~但是，世界上并不是所有的人都能被救，能被救的，只是站在正义一方的人。卫宫切嗣的教导，正是卫宫切嗣的形象。为拯救十人，就要牺牲一人。为拯救百人，就要牺牲十人。背负的使命越来越重。背负的罪也越来越重。所以，卫宫切嗣逃避了。他没有背负这些的能力，也不希望卫宫士郎去背负这些东西。因此，他没有教导卫宫士郎成为魔术师。但却用了极端的方法教导卫宫士郎使用魔导回路，令他的肉体强壮，令他的灵魂坚固。到了达成的那一天，再作为平凡人活下去，拯救最低限度的平凡人就足够了。但时与愿为~~~第五次圣杯战争开始了，寄生在卫宫士郎体内的EXCALIBUR的剑鞘也对圣杯作出了回应。也就是说，卫宫士郎作为第七MASTER参加了第五次圣杯战争。也于此时，卫宫士郎的命运向着别的方向前进。就算破坏了圣杯，卫宫士郎也不能作为一个普通人继续生活。他作为正义的使者，徘徊于战场中。被无数人出卖，与无数人为敌~~~他，也只是带着那借来的理想。背负一切，就算全世界都背叛了他，只要能救出一人，他也能带着微笑。但最后的最初，他被自己所救的男人出卖，被冠以“战争的罪魁祸首”的罪名，送上了断头台。此刻的他，除了“拯救了他的性命的人”（连名字也不知道）的宝石项链。已无任何一物。------------在此，我向您契约。------------此身死后的一切，完全交托给您。------------但，报酬我于此刻带走！向世界定下契约，以拯救十数人性命为报酬。捐献了这副已死之身。他~~~~他在契约完成的时候，他在那无主的剑丘上笑了。那是满足的笑容，那是解脱的笑容。但是，无论救了多少人，拯救了本来无法拯救的人这一点，就已经是奇迹了。圣杯看上了他，他成为了英雄，被冠以守护者之名的英灵。这就是卫宫士郎作为人的最后，和作为英灵的最初。成为守护者，他应该感到满足吧！死后仍然能拯救他人的性命，他应该感到满足！被所有人背叛的他，仍能拯救别人的性命，他应该感到满足！但是他越来越失望。所谓的守护者，只是人类的清道夫，为拯救一人，就要牺牲十人。为拯救十人，就要牺牲百人。被一切背叛的他，再一次被世界背叛。带着无限的轮回，背负着无比沉重的罪！已经没人能对他进行救赎。最终的最终，不知从何时开始，连最初的理想也背叛了他。忘记应该记住的一切，记住应该忘记的一切。他的愿望只有一个==把曾经的他被称为卫宫士郎的人类，在他没成为英灵EMIYA之前，杀掉！圣杯回应了他！在无数平行世界之中，只有如微尘一样机率的愿望！实现了！第五次圣杯战争~~~他作为ARCHER职阶，被远坂凛召唤了出来~~~~--------对不起，我记忆有点混乱。--------不用了，您召唤出来的我，当然是最强的了！忍藏真名，只为把自身杀掉的英灵。在这次的圣杯战争中完成了另一个愿望。另一个时空的那天，远坂凛以同样的行动，拯救了卫宫士郎的性命。宝石项链，就是远坂凛遗留的东西，跨越无数时空，他终于能把原本属于远坂凛的项链归还。（这算是为后面凛同土狼的剧情作铺垫吧~~）但是，他始终都被自己的理想打败。------------抱着理想溺死吧！可能，被溺死的不是卫宫士郎，而是英灵EMIYA自己！理想一直没有背叛他，只是他忘记了一切而已！他在于他自己的对决中明白到了，从拾回卫宫士郎这个名字。但他不能回来，他已经不再是人类了，成为英灵的他，超越了人类，成为了另一种存在了。所以，他为卫宫士郎挡下了吉伽美什的王之财宝。为远坂凛开路，把自己的知识提供给卫宫士郎。-----------只有我们才能打败他，只有作为卫宫士郎的我们能打败他！面对拥有千件财宝的吉伽美什。卫宫士郎完本只是以为通过投影对它进行对抗，但是，EMIYA的说法不是要“对抗”而是要“战胜”------------------我和那家伙的剑制，到底有什么不同？~~~~~~------------------无论是强化也好，投影也好。都只不过是副产物而已。------------------我所能做的，从一开始就只有一样~~~~强化自己的心！------------------所为的身体的极限，根本就不存在！------------------或许，在那片黑暗的彼岸，才是这副身体的极限吧！------------------I am the bone of my sword---------------------透过EMIYA的知识，卫宫士郎创造了称为“无限剑制”的固有结界。那里面，是无限之剑的山丘，每把剑，就如一个个墓碑。那里，才是卫宫士郎的归宿！最后，击败了英雄王的，是卫宫士郎的他们！但是，破坏了圣杯，EMIYA也将消逝~~~~~~-----------------凛，有你陪在他身边，那么就不会有英灵EMIYA的诞生。-----------------我要走了，好好地照顾他吧！随着最后的告别，红衣的英灵在风中褪去了身影。少女的心意，也终于传递了给他！没有阳光的剑之丘，像是回应主人的新生一样，迎来了地平线的第一褛阳光~~~~~~~~~~~~

不是大小的问题 是照片的清晰度的问题 越大的越清楚的。稍微大一点而已，

dollars-appeals

红a和卫宫士郎是一个人。他的真身是“卫宫[Emiya]”。即是在未来为了拯救五百名人类而祈求奇迹，作为代价而英灵化的卫宫士郎。虽是无名的英灵，却把士郎所持的固有结界“无限剑制(Unlimited Blade Works)”锻炼、操纵至极限，跟在场的英灵们势均力敌。作为英灵的他处于“守护者”的立场，拥有以虐杀人类来回避灭亡的职责。屈服于不断重覆的杀人以及人类所展示出的丑陋，对杀死士郎以消灭自身产生了希望。可是他无论在哪条路线，结果都选择为了守护他人而战。他的天性，似乎死了也没有治好。成为英灵卫宫死后如契约所言成为了英灵。纵然因背叛而迎来死亡但他却没有憎恨人类，但讽刺地“世界”给予作为英灵的他的职位就是，“在人类引起自灭时现界、残杀该处的所有人类”的“守护者” 。由于不是和其他英灵一样出自典故，不能被称为正统的英灵，该英灵被称为守护者，是由认为人类“应当延续”的集体无意识所产生的防卫装置般的存在。这种防御装置也被称为灵长类的抑止力，要点在于要选择没有名字的人们，没有知名度的正义代理人。

http://baike.baidu.com/view/6737691.htm#0_1http://baike.baidu.com/view/5699.htm#sub8737715译者：黄志坚青春，并非年轻岁月，而是一种心态；青春的特徵，并非粉颊、朱唇、柔肢，而是毅力、激情、创意；青春是生命涌泉的清澈、激扬。青春，是指超越怯懦、勇气贯长虹，不图安逸、敢闯敢试。毅力若此，花甲多胜弱冠。年岁递增，非必老化；背弃理想，方陷残年。岁月留痕，只及肌肤；但激情不再，枯皱始达心灵。忧愁、惶恐、自卑，终致身心佝偻、精神萎靡。无论年少或年长，当怀好奇的诱导，像孩子般总渴求着：接下来的进展及驰骋人生的欢乐。人人皆有心灵的感官，只要感受源源来自人间与穹苍的启发，感应有关美好、希望、激情、勇毅和能力的信息，你就会朝气勃勃、青春无限。《YOUTH》bySamuelUllman(Excerpt)Source:http://www.uab.edu/ullmanmuseum/Youthisnotatimeoflife;itisastateofmind;itisnotamatterofrosycheeks,redlipsandsuppleknees;itisamatterofthewill,aqualityoftheimagination,avigoroftheemotions;itisthefreshnessofthedeepspringsoflife.Youthmeansatemperamentalpredominanceofcourageovertimidityoftheappetite,foradventureovertheloveofease.Thisoftenexistsinamanofsixtymorethanaboyoftwenty.Nobodygrowsoldmerelybyanumberofyears.Wegrowoldbydesertingourideals.Yearsmaywrinkletheskin,buttogiveupenthusiasmwrinklesthesoul.Worry,fear,self-distrustbowstheheartandturnsthespiritbacktodust.Whethersixtyorsixteen,thereisineveryhumanbeing"sheartthelureofwonder,theunfailingchild-likeappetiteofwhat"snext,andthejoyofthegameofliving.Inthecenterofyourheartandmyheartthereisawirelessstation;solongasitreceivesmessagesofbeauty,hope,cheer,courageandpowerfrommenandfromtheinfinite,solongareyouyoung.

In computering,an application is a piece of software designed to carry out a particular task在电脑中是指用来执行某种特定任务的软件，可以理解为应用程序

红a和卫宫士郎是一个人。他的真身是“卫宫[Emiya]”。即是在未来为了拯救五百名人类而祈求奇迹，作为代价而英灵化的卫宫士郎。虽是无名的英灵，却把士郎所持的固有结界“无限剑制(Unlimited Blade Works)”锻炼、操纵至极限，跟在场的英灵们势均力敌。作为英灵的他处于“守护者”的立场，拥有以虐杀人类来回避灭亡的职责。屈服于不断重覆的杀人以及人类所展示出的丑陋，对杀死士郎以消灭自身产生了希望。可是他无论在哪条路线，结果都选择为了守护他人而战。他的天性，似乎死了也没有治好。成为英灵卫宫死后如契约所言成为了英灵。纵然因背叛而迎来死亡但他却没有憎恨人类，但讽刺地“世界”给予作为英灵的他的职位就是，“在人类引起自灭时现界、残杀该处的所有人类”的“守护者” 。由于不是和其他英灵一样出自典故，不能被称为正统的英灵，该英灵被称为守护者，是由认为人类“应当延续”的集体无意识所产生的防卫装置般的存在。这种防御装置也被称为灵长类的抑止力，要点在于要选择没有名字的人们，没有知名度的正义代理人。

1、cooked，读音：美/ku028akt/。 2、释义：v.烹饪；被烧煮；篡改；伪造；（非正式）干得起劲，干得好（cook的过去式及过去分词）。adj.煮熟的。 3、例句：The cooked vegetables were wasted.这些煮好的蔬菜被浪费掉了。

I want to eat nothing this morning.