双酶切线性DNA需要去磷酸化吗,一条线性DNA分子,双酶切,一个黏性末端,一个平末端,切好的DNA分子片段需要去磷酸化处

重组质粒不进行双酶切直接跑胶,条带应该是多少?

重组质粒不进行双酶切直接跑胶,条带应该是多少?
别人给的质粒,看他们的文献,双酶切之后有两条,分别是490bp（目的基因的大小）和5400bp.现在,我打算把他们寄来的质粒直接去跑1%的琼脂糖凝胶电泳,先不进行双酶切,用10000的marker够了吧,如果有条带的话,也是这两条吗?还是别的情况呢?另外,他寄来的质粒是200ng/ul的,但是 只有一点点的量大概5ul 我做了2次转化都没有跑出条带,实在是量不够啊.我想用最后的1ul稀释成15ul,取5ul去跑胶,剩下的10ul做最后的转化.这样浓度会有影响吗?会因为浓度不够跑不出来吗?

caiye1年前1

江涵秋影 共回答了16个问题 | 采纳率93.8%

别人给的质粒,第一要做的是转化保种啊,别人给那点哪够分析.转化完了自己抽质粒分析.质粒直接跑电泳理论上是三条带,要想分析建议做单酶切再电泳.

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找双酶切位点有哪些原则?我的目的片段连载PMD18-T载体上,现在想做双酶切,再和绿色荧光蛋白的载体连接起来做表达,已经

找双酶切位点有哪些原则?
我的目的片段连载PMD18-T载体上,现在想做双酶切,再和绿色荧光蛋白的载体连接起来做表达,已经确认一个酶EcorI,另一个酶不知道该选哪一个?不知道这其中有什么要注意的事项呢?

nl3ydu1年前1

why_1025 共回答了16个问题 | 采纳率93.8%

另一个酶应该选择和EcoR1共buffer的,酶切温度要一致

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质粒和目的基因片段分别双酶切（bamh1,xba1）连接后电转感受态细胞,同时将质粒酶切回收的片段转化做对照

质粒和目的基因片段分别双酶切（bamh1,xba1）连接后电转感受态细胞,同时将质粒酶切回收的片段转化做对照
质粒和目的基因片段分别双酶切（bamh1,xba1）连接后电转感受态细胞,同时做对照：质粒酶切回收的产物电转,结果对照组长了 ,实验组没长 怎么回事?

天使尘埃1年前4

weimin628 共回答了11个问题 | 采纳率81.8%

问题描述不清.“同时做对照：质粒酶切回收的产物电转”?也就是说拿线性的质粒去电转做对照?
如果是这样,你不如用感受态细胞直接做阴性对照,再用原质粒转化做阳性对照,这样更好分析结果.多克隆位点是很小一段,你认为切成2段,但实际可能只切了一刀甚至一刀都没切完
你还是把过程描述清楚些先

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双酶切鉴定（或者测序）是否含有目的基因的时候,为何用pMD18-T载体?

双酶切鉴定（或者测序）是否含有目的基因的时候,为何用pMD18-T载体?
过程主要是：
从小麦胚胚芽鞘中提出总的RNA,反转录cDNA,然后纯化cDNA,特异性PCR扩增,电泳,得到目的基因,然后连接载体pMD18-T上,再进行双酶切鉴定（或者测序）
希望解释清楚点,我知道pMD18-T载体是克隆载体,但是不知道与我的问题有没有关.

yangxu02151年前1

linguang99 共回答了11个问题 | 采纳率100%

通常先分析一下目的基因上存在哪些常见的酶切位点,
再选择合适的克隆载体.保证你双酶切的位点在目的基因上不会出现.
PMD18-T克隆位点两侧的酶切位点比较多,很常用的.

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双酶切时无通用缓冲液怎么办?如：sfi1和xba1双酶切

ruihoo1年前1

妖精332 共回答了18个问题 | 采纳率100%

那就使用两个酶切体系.
一个酶切完成后,回收核算再进行第二酶切.
没有通用buffer只好如此.

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都说双酶切只能产生1种重组质粒,而且有的资料说单酶切产生的重组质粒是两个.为什么在2009年江苏高考34题中用双酶切时,

都说双酶切只能产生1种重组质粒,而且有的资料说单酶切产生的重组质粒是两个.为什么在2009年江苏高考34题中用双酶切时,答案却是两种重组质粒,而单酶切时产生的重组质粒是一个.

lzddove1年前1

gdxbdwk 共回答了20个问题 | 采纳率85%

很多原因,你可以先确定一下质粒是否已经被酶切（通过和原质粒跑琼脂糖看分子量区别）,再确定你的基因位点是否在载体上还存在（对于多次利用的载体这点很重要）.然后你可以设置不同的体系来尝试连接.并且你要确定你的感受态细胞没有问题

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关于实验中的酶切反应小弟我最近在做酶切,做的是HindIII和EcoRI的双酶切,两个酶的缓冲液不同,所以准备两次酶切,

关于实验中的酶切反应
小弟我最近在做酶切,做的是HindIII和EcoRI的双酶切,两个酶的缓冲液不同,所以准备两次酶切,想请教各位前辈在做完一个酶切到开始第二个酶切之间有什么要注意的吗或者说是具体还要做什么吗?

风旭天使1年前2

张大四 共回答了19个问题 | 采纳率89.5%

你酶切完后要注意第一次酶切后胶回收的回收率要高,而且这样分两步做很麻烦,你不如用HindIII和EcoRI均具有较高活性的buffer,那样又快质量又高.

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SacI XbaI双酶切体系,我以前用的50微升体系,现在想用20微升体系,关键是BUFFER的浓度,

SacI XbaI双酶切体系,我以前用的50微升体系,现在想用20微升体系,关键是BUFFER的浓度,
我曾经用过50体系中两种酶各1，BUFFER用了5，那要是20的体系呢，BUFFER还是1X的么？

艾苘1年前2

飘香美酒 共回答了16个问题 | 采纳率87.5%

uffer都是1×的

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如果质粒dna双酶切电泳后,在胶上出现1）没有条带2）一条3）两条4）三条5）多条,都是什么原因?

孤单的鱼的眼泪1年前2

紫龙旋风 共回答了14个问题 | 采纳率92.9%

1） 质粒上没有这两种酶的酶切位点（或操作失误,试验失败）
2）质粒上只有一种酶的酶切位点或两个酶的位点非常接近（

1年前查看全部

T 载体与 目的基因连接成功,测序结果也正确.从新摇菌,提取质粒,在进行双酶切,一直切不下来.

T 载体与 目的基因连接成功,测序结果也正确.从新摇菌,提取质粒,在进行双酶切,一直切不下来.
用的是 ClaⅠ ,EcoR Ⅰ 两种酶 体系20
酶切 3小时 过夜 都试过了
期待解决

小荷呱呱1年前3

江南狂人 共回答了15个问题 | 采纳率100%

解决办法：1、cla1是一个比较不常见的酶,可能酶切体系和ECOR1的缓冲体系不一样,试着分别酶切,就是先切cla1,然后纯化后切ECOR1；或者查找哪个酶的酶切效率高些,那个后切；2、3个小时可能太短了,我一般都是5个小时,或者过夜；3、可能是你菌挑错了,或污染了,重新调菌或者把原来构建成功的质粒进行转化,再酶切.

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SacI 和BamHI 双酶切 用什么buffer

我是ll我怕谁啊1年前3

break0521 共回答了18个问题 | 采纳率88.9%

不同公司的酶和buffer命名和特性是不完全一样的.像takara公司的内切酶有一个双酶切的列表,列出了每两种酶双酶切最适用的buffer.
像NEB公司的话,酶4种buffer中的活性都列出来了,选一个两种酶活性都高的就可以了.
其他公司的产品也一样,主要是认真阅读说明书和产品资料.

1年前查看全部

双酶切质粒后电泳 双酶切质粒pgl 6.24（5882bp）无共同buffer kPN I 2.5小时 bgl II 3

双酶切质粒后电泳
双酶切质粒pgl 6.24（5882bp）无共同buffer kPN I 2.5小时 bgl II 3.5小时 之后电泳 为什么出来1万多的带?跑的比原来质粒还有10000bp的marker还慢……怎么回事啊……求高人指点

hzxzy1年前3

蛮苕的人 共回答了24个问题 | 采纳率83.3%

很显然是质粒发生了自连啦.切开的2个质粒连起来了,因此相当于2个质粒的大小.你需采用磷酸化避免自连发生.

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质粒DNA双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测为什么没有出现条带 质粒DNA双酶切琼脂糖凝胶电泳检测为什么没%

华木1年前3

抱着被子睡觉 共回答了20个问题 | 采纳率100%

补充一点就是看看你的片段是否有这个酶的酶切位点.尽管有些好笑,但是有人确实犯过这样的错误.你提取的质粒浓度很低的话,在酶切的时候就少加点水多加点质粒.不然浓度低当然看不见.

1年前查看全部

关于PCR产物酶切要构建一个载体目的基因PCR回收后做双酶切应该做多大的体系50 or 100?各种成分为多少?望大家不

关于PCR产物酶切
要构建一个载体
目的基因PCR回收后做双酶切
应该做多大的体系
50 or 100?
各种成分为多少?
望大家不吝赐教!
谢谢!

北方人优等1年前2

尽在2007 共回答了24个问题 | 采纳率95.8%

.
同步双酶切
同步双酶切是一种省时省力的常用方法.选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步.NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer,以保证100%的酶活性.NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书.能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切.由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓,因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间.
2、分步酶切
如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液,就只能采用分步酶切.分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始,酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求,然后加入第二种酶完成双酶切反应.
反应体系的话酶供应上岁产品会给相应的建议.体积多大要看个人实验所需,如果下游实验需要DNA的量很大那建议使用100ul的,如果需要的没有那么多,使用25ul或50ul也就够了.

1年前查看全部

我是新手,要做Xbal和XhoI双酶切实验,想请问一下buffer建议中2XTango是什么意思啊?

我是新手,要做Xbal和XhoI双酶切实验,想请问一下buffer建议中2XTango是什么意思啊?
有没有哪位前辈能告知这两种酶的酶切反应体系,

gsqiqi1年前1

wangjun89 共回答了15个问题 | 采纳率93.3%

登录到fermentas的网站上最上方,在tool部分有一个Doubledigest的工具,点击点击进去以后,把你要切的两个酶勾上,提交,就会给出相应的buffer的建议.
We recommend:
Buffer 2X Tango™
2-fold excess of XbaI
XhoI
Incubate at 37°C

而且还可以看到每一种酶在此buffer中的活性,由于XbaI在2XTango中活性是50-100%,所以建议用2倍的XbaI. 另外,一定要注意XbaI是否有甲基化.

1年前查看全部

用fermentas的Kpn1和bamH1做双酶切,用的buffer是Buffer bamH1,做了几次都是质粒自连,怎

用fermentas的Kpn1和bamH1做双酶切,用的buffer是Buffer bamH1,做了几次都是质粒自连,怎么办

银耳糖水1年前1

liupinjinshi 共回答了20个问题 | 采纳率85%

质粒自连说明双酶切没有切开.
不知道你的buffer是怎么选的,如果两种酶在buffer中的活性不同的话,活性较低的那个可以加大酶量,同时延长酶切时间,或者更换buffer.
条件需要自己摸索.

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请问酶切时分别单酶切可以切动,而双酶切结果和单酶切相同,是怎么回事啊?谢谢啦!

娃哈哈v9we1年前2

250457901 共回答了18个问题 | 采纳率88.9%

切割肯定是都可以的.只不过是用双酶切的话,链接的时候就跟准确.因为在目的基因和运载体上分别都有两个不同粘性末端的切口,假设为切口1和切口2那么基因在和运载体链接的时候,只能基因上的切口1和运载体上的切口1链接,...

1年前查看全部

双酶切的其中一个酶切位点可以在质粒的抗性位点上么?

双酶切的其中一个酶切位点可以在质粒的抗性位点上么?
个人觉得应该是不可以的 想确定下
我的酶切位点其中有个是Pst I,但是不能切开Pet-28a（+）,实验室还有另外一种质粒Pgex-4T-R,但是Pst I刚好在这个质粒的Amp位点上,可以用么?
不然是不是应该改用其他的酶 或者买其他的质粒?
谢谢

人间惆怅客_xf1年前1

coffee1673 共回答了16个问题 | 采纳率87.5%

除非你这个质粒还有其它抗性筛选标记可以用,否则不行

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Takara的NheI 和BamHI双酶切体系表中没有双酶切缓冲体系应该如何选用缓冲液呢?

Takara的NheI 和BamHI双酶切体系表中没有双酶切缓冲体系应该如何选用缓冲液呢?
只能进行分步酶切吗?

绿茶草1年前1

vivian_876 共回答了16个问题 | 采纳率93.8%

1、如果你用的是Takara的酶,应该就只能分步了,而且BamHI还是30度反应,虽然也可以在37度切,但如果是分步切的话还是用30度吧.
2、为什么不用NEB的酶呢?可以用buffer1或2同时切（好像是,你需要自己再确认下）,而且NEB的这两种酶都有HF酶,效率更高,都可以在buffer4中达到100%的效率.
以上,仅供参考~

1年前查看全部

sall和Ecorl能双酶切吗?酶切体系和条件如何

sall和Ecorl能双酶切吗?酶切体系和条件如何
sall和Ecorl能双酶切吗?酶切反应体系和条件如何,想做连接来

我就是mm别猜1年前1

jenny934275 共回答了18个问题 | 采纳率100%

可以,用Takara得酶,缓冲buffer用 一成得buffer H, 其他反映条件同普通反应.我常用50uL反映体系,5ulbuffer 两种酶各1ul,其他得DNA和水补充

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质粒跑电泳大提质粒,未酶切三条带,超螺旋、开环、线性,下面没有其他的杂带了,单酶切也是一条带,而双酶切,却出现三条带,多

质粒跑电泳
大提质粒,未酶切三条带,超螺旋、开环、线性,下面没有其他的杂带了,单酶切也是一条带,而双酶切,却出现三条带,多出了一条,多出的一条750,比正常的400那条带颜色浅.这是为什么呢?

拉丁红1年前2

楼民33号 共回答了25个问题 | 采纳率92%

这个可能性很多啊.
最大的可能是你的酶污染了其他酶.
还有这种问题你要是觉得其他两条带大小正确,就不要太纠结了,往后做吧.
如果非得找原因的话,再重复几次,酶用量,酶切时间之类的多考虑点.

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单酶切和双酶切的定义分别是什么?它们有什么不同?

单酶切和双酶切的定义分别是什么?它们有什么不同?
做实验的时候要把400bp目的片断连到pcDNA3.1(+)质粒中去：单酶切质粒后用T4 DNA连接酶连接,转化到感受态细菌去,涂板有细菌生长,用目的基因的引物做PCR,产物电泳获得目的条带.听说要用双酶切.两者有什么区别?

仙杖1年前1

菁儿猪猪 共回答了21个问题 | 采纳率95.2%

单酶切就是只用一个限制性内切酶去切你的质粒,环状的质粒就成为线状的了,但质粒的大小不变
双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒就变成两段线状DNA了.回收你需要的那一段,因为它的两端和你的目的基因带有互补的黏性末端（当然目的基因也要用这两种酶切才行）,在T4DNA连接酶在作用下,它们就连到一起了.
你该看看《生物化学》或基因工程方面的书.这都是基本的知识啊.

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对于载体的单酶切和双酶切,胶图分别会如何?为什么会这样啊?

公主O1年前1

leisure99 共回答了18个问题 | 采纳率94.4%

单酶切一个电泳道上会有几个比较亮的带,而且你所根据基因大小所选择的条带内也不一定是你要的.原因是单酶切形成的粘性末端完全相同,就像拼图,除了内容不同,两边完全切合.所以结合方式过多,可能性也多,如质粒和目的基因正确连接,质粒和目的基因反转连接,质粒和质粒连接,目的基因与目的基因的连接.
双酶切一般会有3条带,而且正确现象应只有一个是非常亮的.因为两种酶识别两个位点切开,无论是质粒还是目的片段两端的粘性末端完全不同,还是拼图,内容不同,两端切合口也不同,除了一种连接方式外没有其他连接了.胶途中3条带分别为：目的片段条带,空质粒条带,最亮的重组质粒条带.

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