琼脂糖凝胶电泳实验失败原因?实验首先是用PCR扩增DNA片段,然后用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量,结果失败了,EB染

这应该是对提取的DNA进行的电泳,上面亮的带是DNA,下面稍暗的是RNA
提取效果很好,DNA完整无弥散现象,RNA很少只需加少量酶去除.
但你这图片不太清楚,如果不是你照相的问题的话,我建议你该换电泳缓冲液了

应用:
1、DNA的制备.
⑴ 适合分离大片段DNA.
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段,其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广,尤其适于分离大片段DNA.普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb,利用脉冲电泳,可分离高达10^7bp的DNA片段.
在青贮饲料总DNA的提取实验中,是通过琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收来实现的.所提取的DNA纯度较高,可直接用于下游分子操作,提取方法灵敏度高,能全面反映样品中的微生物原貌[1].
在“CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒提取食用菌DNA”实验中,研究人员用了两种方法来提取DNA：一、CTAB法(对照法).二、CTAB与DNA凝胶回收试剂盒（琼脂糖凝胶DNA试剂盒）结合法（结合法）.实验结果表明,与对照法相比结合法提取DNA样品的电泳条带更规则、清晰,且DNA的酶切效率显著高于对照.由此说明,结合法能高效地从富含多糖的材料中分离到纯净的DNA[2].
⑵ 可提取大分子DNA.
在“洋葱帕克霍尔德氏菌HMW·DNA的制备及酶切研究”的实验中提到,构建大片段基因组文库的关键就是获得高分子量的基因组DNA[3].而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA；酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA,但极易造成基因组断裂,也难以得到大于300kb的基因组DNA.两种方法均不能达到目的,但经过研究人员不懈的研究,利用琼脂糖凝胶制备成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段,可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求.在此过程中研究人员在用低熔点琼脂糖还是普通熔点琼脂糖制备凝胶块的问题中选择了后者,因为低熔点琼脂糖价格昂贵且胶块在制备纯化的过程中容易断裂,而普通熔点琼脂糖与低熔点琼脂糖在基因组DNA制备方面没有区别.
1、PCR产物在琼脂糖凝胶上进行的电泳检测.
在基因组DNA的提取中,DNA经孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗涤2次,再适量的双蒸水溶解DNA.然后在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳,以1kb DNA ladder 为参照,估计DNA溶液浓度.具体检验方法是：2.0%琼脂糖制成凝胶,取6 微升 AFLP—PCR产物与1微升上样缓冲液混匀后上样,用1×TBE电泳缓冲液,120V电泳50min,使用EB溶液染色后在凝胶成像系统（ChampGel-3200）上观察拍照[4].
2、琼脂糖在其他方面的应用
⑴ 琼脂糖在免疫扩散法中的应用.
免疫扩散法就是利用琼脂糖凝胶作为扩散介质,使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇,从而形成抗原抗体复合物,由于此复合物分子量增大并产生聚集,不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带.抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障,它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过,而允许那些性质不相似的分子继续扩散,这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置,从而可以分离和鉴定混合系统.
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶,其内部为多孔网状.而且孔径很大,可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过.因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上,所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散.而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点,因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质.
双向琼脂扩散实验中也用琼脂或琼脂糖作为扩散介质,原因同上.
⑵ 琼脂糖在双链DNA探针的合成方法中的作用.
双链DNA探针的合成方法主要有切口平移法和随机引物合成法.
a 切口平移法
影响切口平移反应的几种因素:(a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度.(b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小.(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使用仔细纯化后的DNA.
b 随机引物合成法
随机引物合成法还可以在低熔点琼脂糖中直接进行.
以上是琼脂糖凝胶在生物学各个领域中的部分应用.但由于当今生物研究领域正处于飞速的发展之中,所以琼脂糖凝胶的应用范围可能会更广,会在生物研究中发挥自己应有的作用.
发展举例：琼脂、琼脂糖因为有特殊的胶凝性质,尤其有显著的稳固性、滞度和滞后性,并且易吸收水分,有特殊的稳定效应；已经广泛使用于食用、医药、化工、纺织、国防等领域,据不完全统计,琼脂、琼脂糖的用途已有1000多种,被国际上称为“新奇的东亚产品”.在食品工业中可用于生产：水晶软糖、定型软糖、水产品、肉类罐头、果汁饮料、果肉饮料、米酒饮料、乳品饮料、精品、乳品蛋糕.

种子壳中的DNA含量是很少的,电泳不一定检测得到,而PCR就不同了,灵敏度很高（能放大千百万倍）,最后能检测得到是很正常的了.
你能PCR检测得到,就说明基因组DNA提取成功了,不就管直接电泳的结果.
如果你非得让基因组能电泳检测得到,可以试着先大量提取,最后把提提的基因组DNA浓缩一下,也许得浓缩上十倍百倍或者更高的倍数才能电泳检测得到.

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你自己不是已经回答了吗?
将PCR产物和Marker放在同一块胶里跑电泳（当然是加在两个加样孔中）.Marker一般都有很多条带的,看你的产物在哪两条带之间,就可以估计了.当然也可以拍照后用软件分析,不过也是个估计而已.

DNA如果降解或者混有其他杂质比如蛋白质、RNA的话,在电泳中可以检测的到.
线性的单一DNA样品一般是单条带,质粒的话可能会有2-3条带.
如果条带变宽、变暗、或者变成弥散的DNA条带,表示DNA非特异的降解.‘
如果条带变成多条,表示可能被酶切.如果质粒被单酶切,可能变成一条亮带.
如果有蛋白质污染,上样孔可能发亮.如果有RNA污染,可能小分子量部分会有弥散.
等等.
标准是电泳条带亮度.通过亮度可以粗略计算DNA条带的含量.如果DNA有损失,对应的条带会变暗或者消失

不能溶于酒精
提取中都是用酒精洗脱盐离子使DNA或RNA沉淀下来
本身是不溶于酒精的
混有RNA的话基本是没有影响的
因为RNA比DNA要跑的快
跑完后会在胶的最前段
而且残留的RNA很大部分因为无处不在的RNA酶而降解
所以基本没问题
还有就是跑琼脂糖不用7%的胶
除非是特定大小片段的回收
否则基本用0.8%或1%的琼脂糖做分离就好了

区分不同生物大分子的技术.
跑出来的条带表示具有不同质量、电量、构型的分子.电荷量越大、分子量越小、构型越紧凑,在电场中移动越快,就是跑得越远的带.
比如亲子鉴定,可以通过比对样品的条带相似度判断有无血缘关系.

其实就是必须让缓冲液没过胶而已
可能是为了凝胶的截面上的电场比较均匀把
先加样不太好,加缓冲液的时候,缓冲液进入加样孔,容易把点好的样品给冲出来

这个看上去像是你在做梯度PCR,所以有很多条带是弥散状的,你可以把比较清晰的条带回收回来,作为模板,利用你之前做梯度得到的优化后的PCR条件再进行一次PCR,看效果如何.
补充：这样的话,可能是你不同样本的模板质量不一样,所以有的P出来了,有的没有P出来.而且,这种从基因组上直接PCR的话,一般都会或多或少的有弥散的.

RNA跟DNA不一样,主要现象就是降解
1.提取过程中RNA出现降解
2.洗脱的时候洗掉了
3.18S有部分降解
4.弥散带说明降解严重,杂质过多
5.28S部分降解
RNA完美提出来的话应该是三条带：28,18,5.8
28和18比较亮
而且28是18的2倍量
5.8基本很模糊
可有可无

sigma公司生产的琼脂糖比较多人用,质量也比较好,线性DNA长度可以琼脂糖凝胶电泳来判断呀,这要看你的DNA是多大的了,如果是几KB的话,选择相应的Marker,跑电泳比对一下就知道大小了,如果是10KB以上的话,先用内切酶切,然后再跑电泳比对带型

就是没有提出来,你可以用紫外风光光度计测一下你所提治理的260,看看有没有东西就知道了.

作用：使DNA粘度增大,不要再点样中被漂离凝胶; 加入的指示剂 可指示前沿.
1*的浓度 是个经验.浓度太大,可能产生 DNA和buffer中物质难以分开,拖带；指示剂前沿太宽等 适当增加浓度 没问题,但没必要.

120V,越高跑的越快,但是跑出来的效果会差一些.我一般都是120V跑的,跑多久看你要分出来的带多大,条带之间大小差多少.

如果MARK也不清楚,就是跑胶的问题了,是不是拖尾?如果只是萤光很淡,那么是点样浓度的问题.如果拖尾,可能有以下4种情况：（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染,建议更换缓冲液.（2）上样时样品漂了,建议增加上样缓冲液的用量,以及小心加样.（3）电压太高.（4）适当把你的胶的浓度加大.（根据你的片断大小而定）

取决于分子量大小和体积
分子量小体积小的物质电泳迁移速度快 这个是学生化的常识啊
共价闭合环状DNA结构紧凑 体积小 所以最快
同理 其次为线装 开环
线状你应该可以理解
我主要说说开环 开环就是双链DNA中的其中一条链短裂 然后此时的DNA分子就会变成环状分子 变成一大团东西 此时的体积就比线状大很多了 所以开环速度最慢

蛋白污染可以考虑用酚氯仿多抽提几次,记得吸上清的时候小心点,宁可浪费也别吸到界面.一般后续还需要用氯仿/异戊醇抽提来去除酚.这样基本蛋白污染就可以去干净.实在不行,抽提一次后,就用蛋白酶K消化30min,再抽提.
如果DNA多,RNA污染就添加RNase A消化,你可以中途取少量跑胶检测,RNA去干净了再抽提,再沉淀DNA.

这两个片段太接近了,通过琼脂糖胶很难分开.建议再用一个载体上有的酶,而目的片段上没有的酶来切一下,也就是做个三酶切,这样载体片段就被切断了.

一般都有3条带.据推测跑在最前边的是cccDNA（共价闭合环）,中间的是OC（开环）,最后的有点拖带,稍宽,早期多认为是线状的,但后来专家认为断链质粒发生几率很低,形不成条带,因此现在一般认为是处于复制过程中的1.5倍左右的条带.
以上均为推测,每人真的去证明.
但若将质粒提取液单酶切,将会得到整齐的一条带.我实验室经常用这种方法估计质粒的纯度.

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法.其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用.
　　琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力.但由于其孔径相当大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中.
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应.DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动.由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速率向正极方向移动.

尝试其他退火温度...有人提了,我就不重复了.
如果没有非特异性条带,可以取4-5ul产物,直接作模板进行2次PCR..

一般来说1%的浓度就够了,如果你的样品分子量比较大,可以用2%的,浓度越大,胶越硬.你做的胶不能拿,用的是TBE缓冲液吗?配完后,需要加热至沸腾,然后再冷却.还有,你用的是琼脂粉还是琼脂糖?做胶用琼脂糖,配培养基用琼脂粉.

补充一点就是看看你的片段是否有这个酶的酶切位点.尽管有些好笑,但是有人确实犯过这样的错误.你提取的质粒浓度很低的话,在酶切的时候就少加点水多加点质粒.不然浓度低当然看不见.

最常用1%的,称取琼脂糖1g,加100ml电泳缓冲液（TAE）,微波炉煮沸,冷却到50度时倒胶.

可能是琼脂糖不太好,导致EB在某些地方聚集,从而产生你所说的背景.当然可能也和Buffer有关.

琼脂糖凝胶电泳的染料有许多种,近几年较常用的有：
EB-溴乙锭,EB有较大毒性,可致癌,所以使用时一定要万分小心.EB染色的背景较强.
SYBR Green--也叫荧光绿如蓝,低毒性,但检测灵敏度没有EB高.
GelRed--号称无毒,无皮肤渗入型,有伤口就不好说了.背景荧光弱,但加多了容易出现拖带.由于在市场上价格较高,所以有出现很多仿冒货,买时要擦亮眼睛.

那要看你的目的基因具体的来源,大小级别的特性.TAE和别的缓冲液什么的,也有些影响,还有就是胶浓度,跑胶时候的电压控制什么的.

电泳缓冲液太长时间没有更换,导致其中的核酸分子迁移进入你的凝胶从而使得本底荧光水平升高,建议更换电泳缓冲液后重新进行电泳.

你这第一块是DNA 第二块是质粒?怎么都有两条带?而且看你PCR结果基本没有扩出来啊,也不知道你要问什么问题.

能不能附上你跑完的凝胶图上来?
三个大的方面：
1.样品处理问题.样品纯度差,跑DNA电泳时有杂质蛋白污染（琼脂糖的话可以在紫外光下检查上样孔是否有白色亮团）；样品上样前已有部分程度的降解（拖尾）.
2.试剂问题.凝胶要配好一点（尽量用新鲜的试剂,新鲜配制后即电泳）,胶的浓度把握到位.

呃,简单地说,质粒DNA酶切是因为我们之前在质粒上插入了一些目的片段,将质粒转到细菌里,细菌繁殖,再抽繁殖后的细菌里的质粒,就可以得到大量的含有目的片段的质粒,但我们要的是目的片段,质粒上的其他东西要去掉才行,所以要酶切,把我们要的片段切下来,可是切后目的片段与质粒其他片段混在一起,就要电泳把它们分开,把目的片段条带处的胶切下来,纯化,就得到大量的目的片段了.当然,也可以用此方法判断你的目的片段是不是正确插入质粒了.
不知道你具体想干什么,不过感觉你的目的是鉴定成纤维细胞DNA中某一基因的表达情况,那就和酶切无关了,至少和我上面说的那种酶切无关.
Good luck~

1%的就可以,marker要有小的 否则容易跑出胶

　　电泳发热很正常,不过千万别把胶给热化了.如果你不放心,可以把电压调小一些,没必要一定用规定的电压跑电泳.电压小一点,无非跑得时间长一些,不影响结果.

你给的信息的确很少了.
楼上2位都分析的很好,不过,我补充说一下 露姬雅 关于质粒三条带的解释.现在对于3条带的解释是这样的：最前面跑最快的是超螺旋,质粒是超螺旋的,你电泳的时候最亮很正常；中间的是开环质粒（由于在提取质粒中物理机械力把质粒打断了）；最后是质粒的复制中间体（即没有完全复制的2个质粒连在一起）.可以想象后2者量很少,所以电泳带不亮.
如果不是质粒电泳,只是普通DNA,根据你提供的信息,没有什么可以解释的,只是说明跑的最快的DNA含量最大,其他2条可能是杂带

看你扩增的DNA片段多大?如果是900到几千的,用1.2%—3%的.自己看看,差不多的浓度就可以.轻微的浓度差异没什么问题 胶的浓度越高,跑的越慢

做蛋白电泳应该用聚丙烯酰胺凝胶电泳吧

一般要根据要电泳分离的核酸的分子量大小：分子量大的核酸电泳时使用浓度较小的凝胶,分子量小的核酸电泳时使用浓度较大的凝胶.核酸在浓度越大的凝胶中电泳速度越小.如果胶浓度偏高,可能跑不动,如果胶浓度偏低,可能跑得太快,分不开.
可以查到核酸分子大小与琼脂糖浓度范围的对应关系.

提取过程中操作不当造成基因断裂,或有其他干扰性DNA成分,操作时的污染造成

步骤:
1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.
2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.
3.加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).
4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.
5.电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.
6.观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.
原理:
借助琼脂糖凝胶的分子筛作用,核酸片段因其分子量或分子形状不同,电泳移动速度有差异而分离.

1.根据片段大小配制不同浓度的胶（改变分辨率）,片段越小,需要胶浓度越大.
2.胶要现制先用
3.选择合适的Marker
4.配胶的缓冲液与电泳缓冲液要是同一种,且浓度一致（1倍）
5.点样时要加入loading buffer,并注意,不要将样点到点样孔之外（飘样）,也不要将胶戳漏（漏样）
6.根据片段大小,及电泳检测目的,选择合适的电压及电泳时间
7.EB染色.可选择制胶时加入EB（要在溶玩胶后,且温度至室温时（用手握住制胶容器,不烫手即可））；或电泳结束后,将胶放入EB溶液中染色.

取决于几点：
楼主的marker本身有没有带有荧光染料.我用过的,如promega,都没有.
楼主的凝胶中有没有添加荧光染料.
楼主是否打算用在缓冲液中添加荧光染料的办法来染色.
如果都没有的话,楼主恐怕需要给它点荧光染料.

实验有没有跑标准分子量DNA Marker?如果Marker电泳后条带正常,那么就是PCR无扩增条带；如果Marker也看不见,那就是配胶有问题,或者配胶用的试剂（比如染料）有问题

去除溶解其中的气体,出现气泡会干扰洗脱顺序.（至于为何三次,不知）

超螺旋和线性呗 挺正常的

你用肉眼在观察口看一看,如果看到有亮带,而仪器没显出来,应该是你的仪器被人给调了.滤波片波长等.
如果观察口看不到亮带,有可能是你那个染料出问题了.有些染料－20度保存的,反复冻融也会失效的.

这是根据的DNA的浓度决定的,你的DNA的浓度大的话,你可以少上一点,DNA的浓度小的话,你
可以多上一点,一般我们上3-5微升就可以,就能检测到了,你要是照胶需要图片的话,你可以先少上点,看看情况,再做调整.

那是他们提取的时候变性时间太长,变性的质粒DNA电泳的时候走在超螺旋DNA的前面,染色较淡.
变形的原因通常是上样量太大,也有可能是凝胶、缓冲液的原因.

看溴酚蓝作为指示,溴酚蓝大概跟250bp的条带位置差不多,如果你的条带长度短于250bp,那么溴酚蓝跑到胶的一半长度就可以拍照了；如果你的条带长度大于250bp,那么溴酚蓝跑到胶的三分之二或者四分之三位置就可以拍照了.主要看你经验,多跑几次就有感觉了.

电泳缓冲液一般是1×TAE或者0.5×TBE
TAE一般配制成50×的储存液
组分浓度2M Tris-醋酸,100mM EDTA
配制方法：
1.称量Tris 242g,Na2EDTA·2H2O 37.2g于1L烧杯中；
2.向烧杯中加入约800ml去离子水,充分搅拌均匀；
3.加入57.1ml的冰醋酸,充分溶解；
4.加去离子水定容至1L后,室温保存.

TBE一般配制成10×的储存液
组分浓度890mM Tris-硼酸,20mM EDTA
配制方法：
1.称量Tris 108g,Na2EDTA·2H2O 7.44g,硼酸 55g于1L烧杯中；
2.向烧杯中加入约800ml去离子水,充分搅拌均匀；
3.加去离子水定容至1L后,室温保存.