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一、污染监测一个好的PCR实验室，必须要时刻注意污染的监测，考虑是否受到污染，如有污染，是何原因造成的。通过有效地监测，采取正确的相应措施，防止或消除污染。1、阴性对照：阴性对照是每次PCR实验都必须做的。它包括了标本对照与试剂对照，通过对照确认样本和试剂是否受到感染。2、阳性对照：它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好、经鉴定是该产物的标本。但阳性对照其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂已经使用稳定，检验人员完全掌握时，在之后的实验中应尽可能免设阳性对照。来减小污染概率。4、重复性试验。二、防止污染的方法1、合理分隔实验室：将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增以及PCR产物的鉴定等步骤进行分区或者分室，尤其要将样本处理和PCR产物的鉴定与其它步骤严格分开。 理想的分区为，标本处理区、PCR反应液制备区、PCR循环扩增区、PCR产物鉴定区。2、PCR试剂要做好预混合分装：所有的PCR试剂都应进行小量分装，PCR反应液应尽可能预先配置好，然后再小量分装，在-20℃下保存，以减少重复加样次数，从而避免污染机会。另外，PCR试剂、PCR反应液应当与样品及PCR产物分开保存，不可放于同一冰盒或冰箱。3、吸样枪污染防护：吸样枪是一个非常容易发生污染的设备。如操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘在枪头上，将会成为一个严重的污染源，因而使用吸样枪时要格外小心，吸样要慢，并尽量一次性完成，忌多次抽吸，避免发生交叉污染或气溶胶污染。4、减少PCR循环次数：以PCR产物达到检测水平为宜。5、防止操作人员污染：使用一次性手套、吸头、小离心管。

大鼠灌注取脑；用途：；1.用于常规HE染色，免疫组化分析；2.冰冻切片可以不做脑组织固定；3.不可用于westernblot和PCR；4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作；原理：；心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织；必要性：；1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易；2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤；3.脑内血液大鼠灌注取脑用途：1.用于常规HE染色，免疫组化分析。2.冰冻切片可以不做脑组织固定。3.不可用于western blot和PCR。4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。原理：心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死亡前进行组织的前固定,避免了组织的自溶现象,是脑组织切片观察的常用方法。多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体准确检测其表达位置和量。必要性：1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响。大鼠灌注取脑标准操作规程(SOP)：流程：1) 麻醉 2)开胸 3)心脏左心室穿针,剪开右心耳 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.具体过程：大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板上,置于解剖盘中,开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。Tips：1.多聚甲醛的配置：一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装有500mlDEPC水的玻璃容器（烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4，使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温或4℃保存备用。简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚甲醛，37℃水浴或温箱密封放置2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌流时造成栓塞影响灌流效果。2.制作灌注装置，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用一血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏，直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的有效观察指标。6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。7.后固定：灌流后的脑组织置于4％PFA置4度冰箱内进行后固定，时间>2h，过夜最好。补充：还有一种省时省剂的方法。夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水约100ml，见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的脑组织白而硬。

一般我们在说干细胞时，用到niche，是指在干细胞外面像摇篮笼龛一样保护它的微环境，比较形象，也就沿用以表述干细胞“微环境”的意义；microenvironment就很正规了，就是字面意思，微环境应该是都可以用这个

realmdefense lavacreatures15关。帝国守卫战游戏最新版是一款策略塔防战争游戏，这里拥有24种类别的塔防，105种独一无二的棘手敌人，还有着18为传奇英雄，关卡的难度将会逐步提升，我们必须以策略性的思维来带领我们的英雄走向最终的胜利，完整不同的游戏模式，充分领略塔防游戏的无限魅力。realmdefense lavacreatures游戏的特点超过100个不同的关卡等待你去挑战，使用不同的套路和策略来更加快速通关，刷新记录，多个游戏世界，每个世界有4种塔，不同主题世界要面对的敌人也是不一样的，你能抵挡敌人的几波攻击呢，完整多种不同的模式，还有PVP玩法能够体验，在线与全球玩家比拼，争夺塔防宗师的称号。参加无限模式一次过足塔防瘾，挑战无限供应药剂的游戏厅玩法，使用最少的药剂来获得更高的分数，兰斯洛特能勇敢的治疗友军，霍根可造成爆炸性的伤害，灵活的调配他们，改变你的战术，阿特拉世界充满了奇幻与冒险，防御塔，敌人，游戏秘籍…你想知道的一切，都被记载在百科全书中，进入阿特拉世界，开启你的奇妙游戏之旅。部署速射弓箭手，在地图上用魔法光束切开墙壁，发射咆哮大炮，召唤盟友，帝国保卫战提供不同的选择和挑战，用战略和机智在胜算很小的局面中获胜，在这个杰出的塔防类游戏中，救援手无寸铁的村民，收集重要的资源，并一路招募有着致命能力的传奇英雄，阻止邪恶。

标准曲线的斜率，可以换算到扩增效率

CrystalMilton外文名：CrystalMilton职业：演员代表作品：穿越乡间路合作人物：塔拉·戴维斯

您好，很高兴为您解答。您的意思应该是：madness和crazy的区别吧？madness(名词）意为疯狂，更多是指精神或想法上的癫疯。例句：Hismadnessisoutofcontrol翻译：他的疯狂已经无法控制了。crazy(形容词）(名词）也是疯狂的意思，但是是形容一件事或一个人疯狂。更多的时候是用来当动词的，它的名词一般是craziness例句：Thecrazymanstartedscreaming翻译：这个疯子开始尖叫。

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双生包裹体瑕疵看情况，一般情况有两种。一种是透明的包裹体，对钻石火彩和肉眼观察影响都不大。另外一种是发黑色的包裹体，这种就比较碍眼了，不建议选择。一般来说尽量避免选择黑色晶状物瑕疵、羽状纹瑕疵和包裹体类瑕疵，这种都属于瑕疵中比较大粒的。其他瑕疵一般不在台面上的话基本都属于接受范围。手打求分！！

credulous adj. 轻信的；因轻信而产生的trusting 信任的，信赖的；相信的gullible 易受骗上当的naive 意思是 幼稚的，天真的希望我的回答能对你有所帮助。

定义不同。1、Cream是一种由牛奶脂肪部分制成的食品，通常有浓稠的质地，用于添加口感和增加食物的奶香味道。2、Sauce是一种液体或半液体的调味酱，由多种食材煮熟或混合而成，用于调味食物或增加食物的风味。

挪威quick crew是个组合

weedbomb就是在院子里超多杂草的情况下，一经使用，所有杂草全部清理掉的快速除草剂；而sunscreen则是防晒霜，适合喜欢户外活动的人，有些人喜好户外活动的，你给他用，他用过就到户外去活动喇，那就相应能让他开心嗄！

成本收益分析中BCR是benefit cost ratio的缩写，是指效益成本比，即 = 成本 / 效益。成本收益分析是指以货币单位为基础对投入与产出进行估算和衡量的方法。它是一种是预先作出的计划方案。 在市场经济条件下，任何一个经济主体在进行经济活动时，都要考虑具体经济行为在经济价值上的得失，以便对投入与产出关系有一个尽可能科学的估计。成本效益分析是通过比较项目的全部成本和效益来评估项目价值的一种方法，成本—效益分析作为一种经济决策方法，将成本费用分析法运用于政府部门的计划决策之中，以寻求在投资决策上如何以最小的成本获得最大的收益。常用于评估需要量化社会效益的公共事业项目的价值。非公共行业的管理者也可采用这种方法对某一大型项目的无形收益（Soft benefits）进行分析。在该方法中，某一项目或决策的所有成本和收益都将被一一列出，并进行量化。

不对，应该是：the prompt-increased income. the promptly increasing income.

　　不知道大家青春期的时候有没有疯狂迷恋过某个人，那种感情即便没有得到过回应，但是每每想起来的时候仍然会觉得很美好很难忘。Crush这个词不知道大家有没有听过，许多网友喜欢用这个词来形容这种感觉，尤其是女孩子经常会用到这个词。那女生用crush是想要暗示些什么？有一种感情叫做crush，下面我们就来一起了解下何为crush吧。 　　Crush在英语中既可以作动词来理解，也可以作为名词来理解。Crush作为动词的含义就是挤压、压碎、碾成粉末等。而crush作为名词来理解，可以指代狭小空间中拥挤的人群，也可以用来指代短暂的热恋或迷恋。网友经常会用crush来形容某种感情，这个时候crush的含义大概就是疯狂迷恋、心动或者默默暗恋吧。 　　你有没有遇到过那种第一眼看上去就心动的人，这种感觉可以被称为crush。那种热烈又短暂的迷恋，最常发生在青春期。尽管后来这种喜欢被时间冲淡，最终不了了之，尽管后来的你遇到了别人，喜欢上了别人，但是想起那段crush，心底里还是会有不一样的悸动。Crush真正迷人的地方，在于不管过去多久的时间，你仍然会想要重温它。 　　Crush可以被用来特指女生对男生的迷恋，这种迷恋可以理解为暗恋，但是跟暗恋又不完全一样。它来得热烈而疯狂，就像突然鬼迷心窍一样迷上了某个人，但是当你过了crush的阶段，又可以潇洒放下，不痛不痒。Crush跟暗恋不同的是，没有暗恋那么折磨人，不酸涩，日后回味起来的时候还会觉得有点美好。若是要用一个词来形容crush的话，大概就是青春的样子吧。后来随着年龄的增长，当我们变得越来越成熟，就会越来越难再体会到crush的感觉了。

只有Nora的Nora 夕焼（ゆうや）け小焼（こや）け 雨（あめ）が上（あ）がるよ夕食（ゆうしょく）の匂（にお）い 通（とお）りに満（み）ちてゆく水（みず）たまりオレンジ トンボが通（とお）り过（す）ぎるあの子（こ）がやって来（く）る足音（あしおと）がするいつも一人ポプラにもたれ星座（せいざ）をつないで 空(そら)を见（み）てるみたい仆（ぼく）が鸟（とり）になって君（きみ）を乗（の）せたなら赤（あか）い星（ほし）のあるさそり座（ざ）を巡（めぐ）ろう背中（せなか）でハシャいだ君（きみ）は几（いく）つもの神々（かみがみ）の悪戯（いたずら）な话（はなし）するでしょう肌（はだ）寒（さむ）い日（ひ）は仆（ぼく）を膝（ひざ）にのせ白（しろ）いマフラーわけてくれたよね近顷（ちかごろ）见（み）かけないと淋（さび）しくなった顷（ころ）见知（みし）らぬ谁（だれ）かと手（て）をつないで来（き）た仆（ぼく）の知（し）らない笑（わら）い声（ごえ）がする幸（しあわ）せそうな君（きみ） 今日（きょう）の星（ほし）は远（とお）い君（きみ）と话（はな）すこと 肩（かた）を寄（よ）せること夜（よる）に冷（ひ）えた頬（ほほ） 包（つつ）み込（こ）むこと仆（ぼく）に出来（でき）たなら そこにいれたかなもっともっと仲良（なかよ）しで二人（ふたり）いれたよねさよならさえ伝（つた）えられなくてそれでも仆（ぼく）は今日（きょう）此処（ここ）を出（で）てゆくよまた素敌（すてき）な谁（だれ）かに会（あ）えるかな気纷（きまぐ）れで自由（じゆう）な暮（く）らし 仆（ぼく）は野良猫（のらねこ）

At

enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。这一方法的基本原理是:①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文PolymeaseChainReaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方.聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

男性。。。

区别是acrid （味道或气味）辣的，苦的；辛辣的，spicy 辛辣的。spicy和acrid都有辛辣的意思，

不要超过4个人。沙盒生存游戏在国外其实早已流行，其中颇具代表性的便是2016年发布的《废品机械师》（ScrapMechanic），而这款游戏仅由两人的瑞典团队——AxolotGames开发，同时这个2人团队也是2018年热门生存游戏《Raft木筏求生》开发者。联机人数不要超过4个人，不要创建一些不常理的东西，主机变卡一般都是建的东西导致的，将有问题东西拆了就会缓解卡顿。避免以上两种问题就可以愉快的玩耍了。

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如何获取对 Microsoft Intune 的支持适用对象：Microsoft Intune对于每个 Microsoft Intune 订阅，Microsoft 支持都提供全球技术、售前、帐单和订阅支持。 对于付费订阅和试用订阅，均通过在线和电话两种方式提供支持。有关支持本主题介绍如何获取支持，包括指向可以在其中打开服务请求的页面的链接，以及指向多种语言电话支持的电话号码列表的链接。可参阅 TechNet 上的 Microsoft Intune 文档，或单击 Intune 管理控制台右上角的帮助链接，获取有关 Intune 的自助信息。System_CAPS_note注意如果你使用 Microsoft System Center Configuration Manager或Microsoft System Center Endpoint Protection：要获得 配置管理器 或 Endpoint Protection 的技术支持，请与你的合作伙伴联系，或访问 Microsoft System Center Configuration Manager 和 System Center Endpoint Protection Solution Center 以查找丰富的自助式材料（可选择在线方式或通过电话建立支持请求）。System Center Configuration Manager 或 System Center Endpoint Protection 的技术支持需要付款，或者它将计为你现有的许可协议或顶级支持协议的递减。在线服务请求访问 Office 365 管理中心以创建服务请求。 在标题“创建服务请求”之下，选择要打开票证的问题类别，然后按照说明进行操作。可以跟踪支持请求的状态，如跟踪服务请求中所述。在线技术支持可通过英语和日语提供。 非技术性支持可通过其他语言提供。电话支持请参阅联系 Microsoft Intune 的辅助电话支持以了解各个国家和地区的支持电话号码、支持时间和各个地区所支持的语言。跟踪服务请求若要跟踪支持请求，请转到 Office 365 管理中心。 在“创建服务请求”列表底部，单击“查看所有支持票证”。其他支持选项合作伙伴你可以选择 Microsoft 合作伙伴和委派管理功能，包括创建服务请求票证。 有关详细信息，请参阅 Microsoft Intune 合作伙伴帮助。批量许可如果你已通过批量许可计划向 Microsoft 购买了许可证，请使用下列方式获得支持：要获得与许可证相关的支持和找到密钥，请参阅批量许可服务中心要获得技术支持，请参阅技术支持。对于帐单问题，请参阅帐单和订阅管理支持有关批量许可的一般信息，请参阅批量许可技术支持案例处理和初始响应时间Microsoft 会在案例开立时根据对问题类型和客户影响的评估为案例分配一个严重性级别。 下表中显示了严重性级别的描述以及初始响应时间。 这些响应时间与针对顶级支持客户的响应时间相同。初始响应时间：严重级别操作和支持描述Microsoft Intune / 企业移动性套件顶级Microsoft Intune / 企业移动性套件专业严重性 A（严重）一个或多个服务无法访问或不可用。 生产、操作或部署截止时间受到严重影响，或者将会对生产或盈利能力产生严重影响。 多个用户或服务受到影响。1 小时2 小时严重性 B（高）服务可用，但有所受损。 情况会对业务产生中等程度的影响，并可在营业时间内得到处理。 单一用户、客户或服务受到部分影响。2 小时4 小时严重性 C（中）情况对业务的影响很小。 问题很重要，但不会对客户的当前服务或工作效率产生明显影响。 单一用户会体验到部分中断情况，但有可接受的解决方法。4 小时8 小时支持责任Microsoft 了解，获得合格专业人员及时提供的技术支持是云服务价值主张的关键。 同样重要的是客户的 IT 部门在其用户支持中所扮演的重要角色。管理员角色和责任具有 Intune 管理员角色（包括租户管理员和服务管理员）的人员是你组织中获得授权访问 Intune 管理控制台并与 Microsoft 直接沟通有关 Intune 服务请求事宜的唯一人员。 这些管理员还可能包括你指定为委派管理员的 Microsoft 合作伙伴。管理员的角色是：管理服务管理和帐户维护将服务请求提交给 Microsoft提供用户帐户设置和配置以允许用户访问服务解决客户端连接和软件安装问题解决组织内的服务可用性问题使用 Microsoft 的自助服务支持资源解决支持问题管理员应为组织的用户提供初始帮助。 但是，如果管理员无法借助自助服务支持资源的帮助解决问题，他或她应与技术支持联系。Microsoft 支持角色Microsoft 技术支持的角色是：排除、管理和解决客户问题和呈报收集并验证与特定服务请求相关的信息提供问题协调和解决管理保持与管理员的沟通，来帮助确保问题持续得到解决协助进行许可、开票和订阅查询协助进行采购和试用查询通过调查持续收集有关如何改进服务的客户反馈请参阅

音悦台 里面有

Javascript是最流行的脚本语言之一，也是Web的主要技术之一，这样的优势导致它在嵌入式领域也有一定的作用飞利浦出过一套 Pronto 智能中控设备系列，可以通过编写代码自定义界面和逻辑，控制继电器、串口、红外等设备，适用于家庭和办公室自动化控制。控制设备分为中控主机和控制板（即带彩色触摸屏的遥控器），本身是嵌入式系统，但控制板中存储的自定义逻辑代码就是使用改造过的Javascript脚本规范。为家庭或安装好被控制的设备以后，只需通过必要连线或局域网将中控主机与被控设备连通，再将电脑上编写好的脚本和配置文件通过USB口传到控制板上，就可以使用了。电脑端编辑是半图形化半文本式的界面（类似Visual Studio和 Xcode 的使用），代码编写又不难，因此上手非常容易。编写界面和最终的控制板使用体验都很好。“ProntoScript 是一种基于 JavaScript 的软件工具，它使安装人员能够创建动态的双向用户界面，利用全图形的灵活性对 RS232 或 IP 进行系统控制。该工具集成在 ProntoEdit Professional 软件中。与 Pronto 合作伙伴预建的 ProntoScript 模块可通过网站获得。对于典型安装，您可以选择使用标准安装参考文件，重新分配各个组件即可。更高级的 JavaScript 编程人员能够创建他们自己的 ProntoScript 模块，以便进行全面的系统操作和反馈。”可惜不知为何没有后续研发新产品。

CR：完全缓解急性白血病疗效标准一、缓解标准：（1）完全缓解（complete remission，CR)骨髓象：原粒（原单+幼单或原淋+幼淋）≦5%，红系和巨核细胞系正常。(注意M2b、M3、M4、M6、M7的标准）血象：男性Hb ≧100g/L,女性和儿童Hb ≧90g/L，中性粒细胞绝对值≧1.5X10^9 /L，血小板≧100X10^9 /L，外周血分型中无白血病细胞临床：无白血病浸润的症状和体征，生活正常或接近正常（2）部分缓解（partial remission，PR)骨髓：原粒（原单+幼单或原淋+幼淋）>5% 但≦20%或临床、血象2项中有一项未达完全缓解标准者（3）未缓解（non-remission，NR) ：骨髓象、血象及临床3项均未达上述标准者二、复发标准：有下列三者之一者称为复发（relapse):(1)骨髓原粒（原单+幼单或原淋+幼淋）>5%但≦20%，经过有效抗白血病治疗一个疗程仍未达完全缓解者；（2）骨髓原粒（原单+幼单或原淋+幼淋） > 20%者；（3）骨髓外白血病细胞浸润者三、持续完全缓解(continual complete remission，CCR)：从CR起其间无白血病复发达3-5年者四、长期存活：白血病自确诊之日起，存活时间（包括无病或带病生存）达5年或5年以上者五、临床治愈：指停止化疗5年或无病生存达10年者

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no cross，no crown没有挫折，不得桂冠双语对照例句:1.No pains, no palm; no thorns, no throne; no gall, no glory; no cross, no crown. 没有劳苦，不得胜利；没有荆棘，不得冠军；不尝苦胆，不得辉煌；没有挫折，不得桂冠。2.No pain, no palm; no thorns, no throne; no gall, no glory; no cross, no crown. 没有播种，就没有收获；没有辛劳，就没有成功；没有磨难，就没有荣耀；没有挫折，就没有辉煌

crown of thorns 荆棘之冠; 铁海棠; 麒麟花; 花麒麟;[例句]His loyalty to the king brought him nothing but the crown of thorns.他对国王的忠心并没有得到回报，却给他带来了屈辱与苦难。

歌曲名:Crown Of Thorns歌手:Sweetbox专辑:糖果盒子45超精选Sweetbox Complete BestCrown Of ThornsBy kingwu1984Does it really matter when it feels so goodI don"t really wanna walk awayBut I don"t want to walk through the fire againAnd if it hurts I call it a dayI"m gonna give all if you catch my fallIn time and space, nothing at allI throw away my crown of thornsIf you call my name I"ll be thereIf I hear your voice, I couldn"t regretThere"s something different about youNow and forever, you always will be thereBut I can"t let you go foreverI"m gonna give all if you catch my fallIn time and space, nothing at allI throw away my crown of thornsIf you call my name I"ll be theresoloStill we run, my pride is goneI"m standing alone and I bleedI throw away my crown of thornsIf you call my name I"ll be thereI throw away my crown of thornsIf you call my name I"ll be therehttp://music.baidu.com/song/802637

Crown of Thorns荆棘之冠 拼音 双语对照 Crown of Thorns网络荆棘冠; 荆棘之冠; 山楂花; 荆棘冠冕

眼霜和眼胶是两种常见的眼部护肤产品，在功效、质地和使用方法上有一些区别。眼霜和眼胶在功效上有所不同。眼霜通常是含有丰富营养成分的乳状质地，旨在提供深层滋养和滋润。它们可以帮助减少细纹和皱纹，淡化黑眼圈，改善肌肤弹性，并保护脆弱的眼部皮肤免受环境和岁月的伤害。而眼胶则更注重去除浮肿和消退眼袋，具有舒缓、紧致和消水肿的功效。眼胶通常以凝胶状或透明凝露状为主，质地清爽且容易被皮肤吸收。眼霜和眼胶在质地上也存在差异。一般来说，眼霜较为滋润，质地相对厚重，需要使用指腹轻轻按摩至吸收；而眼胶则更清爽轻薄，很容易在肌肤上形成一层薄薄的保护膜。两者的使用方法也有所区别。通常建议使用眼霜时，在清洁后取适量，用指腹轻轻按摩涂抹在眼周肌肤上，避免过度拉扯和摩擦。而眼胶则一般可直接涂抹或用指腹拍打于眼部肌肤上，以促进吸收。总结起来，眼霜和眼胶在功效、质地和使用方法上存在一些不同。根据个人的需求和偏好，可以选择适合自己的眼部护肤产品。皮肤主任也推荐了蜜能眼霜，这款产品备受消费者喜欢和好评。希望这些信息能对您有所帮助！

歌曲名:Crash歌手:Aaa专辑:Choice Is YoursAAA - Crash作词：松井五郎作曲：原一博太阳が眩しいせいか顽丈なRuleのせいか爱までがついにPoison渇いて饥えてる抵抗もできないBaby魂は饲われたBooby世界はどこもPrisonことばも夺われWow Oh Wow What do you want?いまのままでいいはずがないWow Oh Wow What do you do?いまここからはっきり叫ぶんだyahどっちに决めるんだ yahどうにかしたいんだyahDon"t stop my Bloodはっきり生きるんだyahどっちも行けるんだ yahどうにかできるんだyahDon"t stop your Blood狞猛なHeartを抱いて従顺なVeilを剥いでRopeを千切れるPassion眠らせたくない感情を揺さぶるBaby时代はいつでもShabby自分と向かい合うTensionぶつかりあうだけWow Oh Wow What do you want?谁かの言いなりじゃつまらないWow Oh Wow What do you do?なにかがあるはっきり叫ぶんだyahどっちに决めるんだ yahどうにかしたいんだyahDon"t stop my Bloodはっきり生きるんだyahどっちも行けるんだ yahどうにかできるんだyahDon"t stop your Bloodこの先安定なんてないぜOne Dayだって至って退屈な日々かい潜ってまずは现状打破する事ないぜ远虑なんか自らの限界が描いたでかい壁踌躇无く吹っ飞ばす“The World is Yours”ほら　そっから明日に手伸ばした先に何が见える？？Wow Oh Wow What do you want?锖びた壳なら　壊したいWow Oh Wow What do you do?いますぐやれはっきり叫ぶんだyahどっちに决めるんだ yahどうにかしたいんだyahDon"t stop my Bloodはっきり生きるんだyahどっちも行けるんだ yahどうにかできるんだyahDon"t stop your Bloodhttp://music.baidu.com/song/1025201

PCR是DNA的体外扩增技术. PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成： 即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3"端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5"→3"方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术.它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定.过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑. PCR技术简史 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”. PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应.其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA,寡核苷酸引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间. PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段,其缺点是：①Klenow酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加.②引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板和引物之 间的碱基错配,其PCR产物特异性较差,合成的DNA片段不均一.此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点,但由于 Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难.这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视.1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望的一种DNA片段.但每循环一次,仍需加入新酶.1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶.此酶具有以下特点：①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%.②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶.③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率,增加了扩增长度(2.0Kb).由于提高了扩增的特异性和效率,因而其灵敏性也大大提高.为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别,将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase).此酶的发现使PCR广泛的被应用. PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需 2～4分钟,2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝. PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%, 但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进 入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情 况下,平台期的到来是不可避免的. PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5"端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3"端开始延伸,其5"端是固定的,3"端则没 有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合.引物在与新链结合 时,由于新链模板的5"端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3"端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”.不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计, 这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用. PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增. 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp,常用为20bp左右. ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段. ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带.ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列. ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3"端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带. ⑤引物3"端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败. ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处. ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性. 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会. 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少. dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性.dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris.HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5,小量分装, -20℃冰冻保存.多次冻融会使dNTP降解.在PCR反应中,dNTP应为50～200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配.浓度过低又会降低PCR产物的产量.dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低. 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本. SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀 核酸.提取的核酸即可作为模板用于PCR反应.一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接 用于PCR扩增.RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA. Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜.Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少. PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数. 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性). ①变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.一般情况下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则 需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败. ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素.变性后温度快速冷却至40℃～60℃,可使引物和模板发生结合.由于模板DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞.退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长 度.对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想.引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec,足以使引物与模板之间完全结合. ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时, DNA合成几乎不能进行. PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合.PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够 的.3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min.延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现.对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些. 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度.PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度.一般的循环次数选在30～40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多. PCR反应特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性. 其中引物与模板的正确结合是关键.引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的.聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度.再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高. 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平.能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌. 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2～4 小时完成扩增反应.扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广. 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板.可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测. PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增 ,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论.PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法. 凝胶电泳分析：PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性.PCR产物片段的大小应与预计的一致,特别是多重PCR,应用多对引物,其产物片断都应符合预讦的大小,这是起码条件. 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶,供检测用. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析. 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点,用相应的酶切、电泳分离后,获得符合理论的片段,此法既能进行产物的鉴定,又能对靶基因分型,还能进行变异性研究. 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据,也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法. Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,与PCR产物杂交.此法既可作特异性鉴定,又可以提高检测PCR产物的灵敏度,还可知其分子量及条带形状,主要用于科研. 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上,再用内部寡核苷酸探针杂交,观察有无着色斑点,主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析.

就胞嘧啶而言是dctp.就四个碱基的mix则为dntp（n=a,t,c,g）.因为是以此底物为原料,要加在3"-OH上需要高能建.dnmp是没有高能磷酸键的,而dntp则有两个.但最后在DNA链中的形式是dnmp.

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。参考资料：

聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 特异性强 　　PCR反应的特异性决定因素为： 　　①引物与模板DNA特异正确的结合； 　　②碱基配对原则； 　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 　　④靶基因的特异性与保守性。 　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 　　灵敏度高 　　PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 　　简便、快速 　　PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 　　对标本的纯度要求低 　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 PCR反应特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。 分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。 Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。 斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可

PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

一段已知的目的基因的核苷酸序列（DNA模板）引物四种脱氧核苷酸热稳定DNA聚合酶（taq酶）

标准的PCR过程分为三步： 1.DNA变性 　　（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA 2.退火 　　（25℃-65℃）：系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链. 3.延伸 　　（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,活性最佳）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链. 　　每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍.如图所示： 　　现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.

他们有完全不同的差别，因为第一个诶，它是螺旋式的耳PCR，它是渐进式的。

1、核酸的基础研究：基因组克隆2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序3、反向PCR测定未知DNA区域4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控6、cDNA末端快速扩增技术7、检测基因的表达8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学。

细菌培养检查

体系是：PCR buffer，Taq酶，dNTPs，引物，模板，ddH2O补充至20ul或50ul体系。举例：10 × buffer： 2 ul dNTP（2.5mmol）： 2ul 引物（2.5umol）： 1.5ul 模板： 1ul Taq： 0.2ul ddH2O： 13.3ul程序：1 94度 5min 2 94度 1min 3 55度 1min 4 72度 2min（1min 1000bp） 2-4重复35个循环 5 72度 10min 6 4度 hold

多聚酶链式反应扩增DNA片段.

　标准的PCR过程分为三步（如图所示）： 　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下, 　　氢键断裂,形成单链DNA 　　2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低,引物与 　　DNA模板结合,形成局部双链. 　　3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 　　性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延 　　伸,合成与模板互补的DNA链. 　　每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍. 　　现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5"-3")的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

PCR是Post Customer Recycled的缩写，不是什么材质。是消费后再生塑料的统称。

1、PCR是聚合酶链式（PolymeraseChainReaction）反应的简称，是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域，几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变，在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。 2、PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR类似于DNA的天然复制过程，是利用合成的两段已知序列的寡核苷酸作为引物，在热稳定的DNA聚合酶的作用下，扩增位于两引物之间的特定DNA片段。PCR包括三个基本步骤：变性、退火、延伸

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2.模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

　标准的PCR过程分为三步（如图所示）： 　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下, 　　氢键断裂,形成单链DNA 　　2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低,引物与 　　DNA模板结合,形成局部双链. 　　3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 　　性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延 　　伸,合成与模板互补的DNA链. 　　每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍. 　　现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.

聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction）， 聚合酶链式反应简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。详细见这个网址http://baike.baidu.com/view/2764.htm

1、PCR是聚合酶链式（PolymeraseChainReaction）反应的简称，是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域，几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变，在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。 2、PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

pcr是指聚合酶链式反应。聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对，这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，台湾科学家钱嘉韵，发现了聚合酶，为PCR技术发展做出了基础性贡献。临床应用：1、感染性疾病。PCR在医学检验学中，最有价值的应用领域，就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。2、肿瘤。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。3、遗传病。PCR技术首次临床应用，就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

聚合酶链式反应简称PCR(英文全称:Polymerase Chain Reaction) 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点

聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction） 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点.它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术.

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖

区别：对未知序列进行测序，可以通过PCR把整段基因都扩增出来，但是因为现在测序的技术限制，DNA片段两端的序列是测不出来的，直接PCR产物测序的结果只能获得基因中间部分序列。所以利用细菌的T载体进行TA克隆，把基因整合到质粒上扩增，然后用质粒上的引物再PCR，让整个目的基因成为新一轮PCR产物的中间部分，这样再测序就能够获得整个目的的全长序列。另外，PCR扩增平均每1000个碱基就有两个错误，保真性远不及菌体内复制。

呃……PCR知道吧？polymerasechainreaction聚合酶链式反应TaqPCR应该就是用普通的TaqDNA聚合酶的PCRRTPCR有的时候指reversetrascriptionPCR，逆转录PCR。有时指real-timePCR，实时荧光定量PCR。LDPCR指long-distancePCR长距离PCR，是普通PCR的一种优化，扩增10k以上片段

enzyme linked immunosorbent assay，ELISA。指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

qRT-PCR（定量逆转录聚合酶链式反应）是利用逆转录酶将RNA模板转录为cDNA，再使用Taqman探针或SYBRGreen等荧光染料检测cDNA的定量过程。以下是关于qRT-PCR原理的更加详细介绍。首先，RNA模板经过逆转录反应转化为cDNA，其中需要引物与逆转录酶配合作用，以产生目标序列所需的反向链DNA。一般情况下，选择特异性引物，以确保只转录我们所需的mRNA。然后，应用荧光染料探针或SYBRGreen等探针，通过PCR过程进行放大，并以探针特异性或荧光信号变化作为结果检测。荧光染料可以识别PCR过程中释放的特定碱基，因此在每个PCR循环结束后，荧光信号相应上升。qRT-PCR技术的原理是以荧光分子为探针，荧光分子会跟随或结合到目标DNA或RNA分子中，并发出明亮的信号作为检测结果。该技术通过扫描每个PCR循环和试管中的荧光信号，确定了DNA和RNA的具体存在量。相比传统PCR技术，qRT-PCR可实现高度精准和特异性的定量检测，具有高灵敏度、快速、准确等优点。广泛应用于分子生物学、临床检测和疾病诊断等领域，在基因表达定量、病毒检测、肿瘤标记物检测等方面发挥着重要作用。综上所述，qRT-PCR技术是一种利用逆转录酶将RNA转录为cDNA，再通过PCR荧光探针或SYBRGreen等等检测手段进行定量分析的方法。该技术具有高精准度、高灵敏度和高特异性等优点，在分子生物学、临床诊断等领域具有广泛的应用前景。

pcr 仪器功能及应用范围？

标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3"端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3"端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA

PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析.引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行,临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作,PCR自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品,PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致.现将几种主要影响因素介绍如下.　　一、温度循环参数　　在PCR自动热循环中,最关键的因素是变性与退火的温度.如操作范例所示,其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s,共25～30个循环,扩增片段500bp.在这里,每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算.在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s,这一迟滞时间的长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差,在设置热循环时应充分给以重视和考虑,对每一仪器均应进行实测.　　关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远,合成靶序列全长所需的时间也越长,前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的.下面就各种温度的选择作一介绍.　　1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动.变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量.一般取90～95℃.样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度.DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要；反之,在高温时间应尽量缩短,以保持Taq DNA聚合酶的活力,加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃.　　2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降；温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加.一般先由37℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应的最适退火温度.也可根据引物的（G+C）%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算：Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃　　其中A,T,G,C分别表示相应碱基的个数.例如,20个碱基的引物,如果（G+C）%含量为50%时,则Ta的起点可设在55℃.在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成,长时间退火没有必要.　　3．引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度.一般取70～75℃,在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒.每分钟可延伸1kb的长度,其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质.扩增片段如短于150bp,则可省略延伸这一步,而成为双温循环,因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成.对于100～300bp之间的短序列片段,采用快速、简便的双温循环是行之有效的.此时,引物延伸温度与退火温度相同.对于1kb以上的DNA片段,可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min,与此同时,在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂,使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段.　　4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期.一般的错误是循环次数过多,非特异性背景严重,复杂度增加.当然循环反应的次数太少,则产率偏低.所以,在保证产物得率前提下,应尽量减少循环次数.　　扩增结束后,样品冷却并置4℃保存.　　二、引物引物设计　　要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核苷酸引物,所谓引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度,两引物的5"端决定扩增产物的两个5"末端位置.由此可见,引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键,引物设计也就更为重要.　　引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的,两引物之间的序列未必清楚,这两段已知序列一般为15～20个碱基,可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物,除此之外,引物设计一般遵循的原则包括：　　1．引物长度根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次.因此,引物长度一般最低不少于16个核苷酸,而最高不超过30个核苷酸,最佳长度为20～24个核苷酸.这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72℃）下不会形成稳定的杂合体.有时可在5"端添加不与模板互补的序列,如限制性酶切位点或启动因子等,以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5"端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的.　　有时引物不起作用,理由不明,可移动位置来解决.　　2．（G+C）%含量引物的组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体.两个引物中（G+C）%含量应尽量相似,在已知扩增片段（G+C）%含量时宜接近于待扩增片段,一般以40%～60%为佳.　　3．引物内部应避免内部形成明显的次级结构,尤其是发夹结构（hairpin structures）.例如：　　4．引物之间两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3"端,即使无法避免,其3"端互补碱基也不应大于2个碱基,否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）.所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下,一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段,是PCR常见的副产品,有时甚至成为主要产物.　　另外,两条引物之间避免有同源序列,尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段,否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样,引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列.否则,引物就会与其它位点结合,使特异扩增减少,非特异扩增增加.　　5．引物3"端配对DNA聚合酶是在引物3"端添加单核苷酸,所以,引物3"端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格,这样才能保证PCR有效扩增.　　引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定.　　人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质.纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长；一般情况下,不用的引物应保存在-20℃冰箱中,在液体中引物能保存6个月,冻干后可保存1～2年.

聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：PolymeraseChainReaction）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成copy一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩知增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外道引物定向酶促扩增技术。

Polymerase Chain Reaction

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖

PCR是聚合酶链式（Polymerase Chain Reaction）反应的简称，是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域，几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变，在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。参考资料PCR技术原理.丁香通[引用时间2018-5-11]

PCR实际上是在体外模拟DNA体内复制的过程.和体内DNA复制一样,PCR在扩增DNA的时候也会经历DNA双链的解开（变性）,寡聚核酸与单链DNA的结合（退火）,以及DNA聚合酶开始合成DNA（延伸）的三个过程.但PCR和体内DNA复制不同,在体内DNA的复制整个过程是由一系列酶所控制的,所以像DNA解链等在体温下就可以完成.而PCR则需要一个高温来完成DNA的解链,所以PCR反应的DNA taq聚合酶是耐高温的酶.此外,无论体内或者PCR反应,DNA的合成都需要一小段寡聚核酸作为引物提供3‘羟基末端,以让DNA聚合酶识别并开始合成DNA.在体内这个3"羟基末端是由寡聚的RNA提供,而在PCR中则由寡聚的DNA提供,因为DNA分子比RNA分子稳定易于储藏和使用.在体内双链DNA聚合方向是5‘-3"的,其中一条链是5‘-3",而另外一条链虽然也是5‘-3",但它是由冈崎片段连接起来的,而总体的合成方向是3‘-5".在PCR反应中,每一条链的合成方向都是5‘-3",没有类似冈崎片段的东西.在体内,DNA聚合是从复制起始位点开始的,由聚合酶识别复制起始位点.而在PCR反应中,DNA的聚合是从引物结合处开始的,主要是由引物的特异性来控制复制的起始位置.基本上就是这样了.我们是验室用BIOG KIT做PCR实验检测目标RNA，做下来S型曲线的起跳值在28左右

基本原理：在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。基本步骤：变性：加热使双链DNA变为单链； 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 ；延伸：耐热DNA聚合酶按5"→3"方向催化以引物为起始点的延伸反应。生物一一四。

　　1、PCR是聚合酶链式（PolymeraseChainReaction）反应的简称，是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法，这是迄今为止最为重要的技术之一。PCR技术的影响不仅仅局限于生物科学领域，几乎人人都可以感受到PCR所带来的改变，在亲子鉴定以及犯罪调查中PCR技术便有广泛应用。 　　2、PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

pcr是聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1976年，中国科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5"-3")的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

PCR（聚合酶链反应）是一种模拟天然DNA复制的体外扩增技术，通过事关反应，使极少量的基团组DNA的特定基因片段在短时间内扩增上百万倍！这个好像在蛋白里！我忘了！不过这个概念肯定是正确的！

　标准的PCR过程分为三步（如图所示）： 　　1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下, 　　氢键断裂,形成单链DNA 　　2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低,引物与 　　DNA模板结合,形成局部双链. 　　3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 　　性）的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′ 端延 　　伸,合成与模板互补的DNA链. 　　每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍. 　　现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度.