生物标记emsa中可能出现探针生物素丢失吗

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

EMSA全称是Electrophoretic Mobility Shift Assay，中文叫凝胶迁移实验或电泳迁移率实验，它是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术，可用于定性和定量分析。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，然后在跑PAGE胶，结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢，这样，从PAGE胶的电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。

没做过

凝胶阻滞或电泳迁移率变动实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA） （来自《养鲤鱼》微信公众号） 1、为什么看不到迁移带？ 1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。 2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。 3）探针与蛋白无特异性的相互作用。 4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。 5）曝光或者成像时间过短。 在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因： 6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。 7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。 8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。 9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。 2、为什么实验背景高？ 1）曝光或者成像时间过长。 2）封闭时间不足或者效率不高。 3）洗涤效果不佳 4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。 3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？ 对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。 部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。 无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。 4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？ Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。 为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。 5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？ 将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。 当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。

转录因子和蛋白质结合的情况可以通过多种实验来验证。以下是常用的几种实验方法：1. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)：通过电泳迁移实验可以观察到转录因子与DNA结合后，复合物的迁移速度会变慢。而加入竞争性DNA片段或者抗体等会破坏该结合，从而使复合物不稳定，以致迁移速度回到原来的状态。2. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay：通过在细胞内部免疫沉淀转录因子及其结合到DNA上的小段染色质并清洗后，进一步检测其结合到靶基因上（序列分析）或者使用引物鉴定附着区域是否被转录因子组件包含。3. Yeast two-hybrid assay：此实验利用了酵母细胞中两个不同功能区蛋白（例如AD和BD）构建相互作用模型。将编码转录因子和其鉴定出的结合蛋白浸入到不同功能区的酵母中进行配对，如果有关联，则证明它们可以在活细胞中相互作用。这些实验都可以可靠地验证蛋白质与转录因子之间的结合关系。在实验室操作过程中，需要根据具体情况选择合适的实验方法，同时保证实验条件的严谨性和准确性。

在EMSA实验中，根据目的不同，所需使用的蛋白质量也会有所变化。通常情况下，蛋白的使用量为1-10微克之间。但是需要具体根据实验需要进行调整。EMSA凝胶迁移实验用于研究蛋白与核酸结合的实验技术。该实验以聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础，利用电泳的原理来检测蛋白与DNA或RNA分子的配对情况。emsa实验蛋白用量1、蛋白用量的确定EMSA实验中，蛋白的使用量应该通过实验计算、考虑样品量和标准曲线绘制等操作来确定2、样品准备首先从生物样品中提取目标蛋白，并用SDS-PAGE对蛋白进行定量和纯化。通常情况下，可以将纯化后的蛋白样品以50-100微克/微升的浓度储存，并适当稀释用于实验分析。3、滴定法测定蛋白浓度滴定法常用于测定蛋白质的浓度，在EMSA实验的蛋白用量计算中也有重要作用。首先，需要准备一定浓度的荧光素化合物（如BCA），然后将标准蛋白和待定蛋白分别用不同的浓度稀释，添加适量的荧光素试剂，并根据颜色变化来测定样品蛋白质的浓度。4、选择适当的蛋白量经过滴定法测定蛋白质浓度之后，可以选择适当的蛋白量进行实验。在实验中，蛋白质的使用量通常在1-10微克之间。如果使用的蛋白过多，可能会影响实验结果，使得最终的检测信号过强，掩盖低浓度样品的信号。而使用的蛋白过少，则很难观察到目标蛋白和DNA或RNA结合的迁移带。5、实验过程中的注意事项在EMSA实验过程中，还需要注意一些重要的步骤和原则，以确保实验结果的可靠性和准确性。如样品预处理、电泳缓冲液的选择和pH值的调节等。此外，为了避免扰动实验结果，还需要注意实验条件的控制，如温度、湿度、时间和光照等因素。EMSA凝胶迁移实验中，蛋白的使用量通常在1-10微克之间，但需要具体考虑实验需求、样品量等情况进行调整。在实验过程中，还需要注意一些重要的步骤和原则，以确保实验结果的可靠性和准确性。

EMSA实验实验背景高主要原因1）曝光或者成像时间过长。2）封闭时间不足或者效率不高。3）洗涤效果不佳。4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。使用UVA(365nm)、UVB(302 nm)、UVC(254 nm)三种波长四款紫外交联仪，主要包括VL-1000A系列紫外交联仪（365nm）、VL-1000B系列紫外交联仪（302nm）、VL-1000C系列紫外交联仪（254nm）、VL-3000系列紫外交联仪（三种波长）满足不同的科研需求。

EMSA 凝胶迁移实验检测的蛋白与其靶分子（通常是DNA或RNA）结合后形成的复合物在凝胶上出现了迁移减缓或者移动位置发生改变。一、蛋白在胶孔中滞留，可能是由于以下几个主要原因：1、胶溶液中存在高浓度的离子：高浓度的离子可以干扰蛋白与DNA或RNA的相互作用，从而影响迁移结果。2、蛋白与DNA或RNA的比例不恰当：如果加入的蛋白太多，会出现蛋白与DNA或RNA的比例失衡，导致蛋白在胶孔中滞留。3、组装复合物时间过长：如果组装复合物的时间过长，会导致复合物形成过程不完全或者不稳定，这也会导致蛋白在胶孔中滞留。4、蛋白稳定性不佳：如果蛋白质无法在凝胶电泳过程中保持稳定性，也会导致其在胶孔中滞留。蛋白质胶孔滞留问题的解决方法是：1、减少离子浓度2、调整蛋白与DNA或RNA的比例3、适当缩短组装复合物的时间，并检查蛋白的稳定性。4、在加载样品时，应尽量避免将蛋白团块直接加入凝胶孔中，而应该将其预先均匀混合。如果以上方法仍然不能解决问题，可能需要重新优化实验条件。

每个对照组的目的：1. 看光有探针，没有其他成分时，探针的位置，应该位于最下方。不然说明探针里面有杂质，影响电泳2. 这个是看蛋白和探针的结合，是实验目的3. 看探针结合的特异性。如果冷探针可以竞争结合，阻碍了标记的探针，说明2中的结合是特异的4. 目的和3相同。突变的冷探针应该对2的结果没有影响5. 也是判断特异性，这次是看蛋白的特异性，和抗体结合后，就会有super-shift。如果没有，说明是其他的蛋白结合。

1.EMSA中一般都是用P标记的探针，具有放射性，要是用生物素标记的话，放射性就小了，但是花的钱就多了。这个实验要是样本不多的话，大约花费4000左右吧，最重要的是放射性的问题，必须有磷屏，否则没法做。2.首先说应该用磷酸化的P65抗体，一般都用santa cruz公司的。并且有分装的，420块钱100μl，你要是做得少的话可以选择分装的抗体。3.还有就是免疫组化也是可以的。还有一种更好的方法就是promega的双荧光素酶报告系统，采用海肾和萤火虫两种荧光素酶，一种报告目的基因，一种报告内参，很好的方法，但是很贵。总体来说，做EMSA和双荧光素酶是最好的方法，算是定量，但是EMSA有放射性，双荧光素酶比较贵。western和免疫组化只能用来半定量，但是做的人比较多，也能发高水平的杂志，相对来说比较简单，也省钱。

EMSA结合反应：(1) 如下设置EMSA结合反应阴性对照反应：Nuclease-Free Water 7微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升标记好的探针 1微升总体积 10微升样品反应：Nuclease-Free Water 5微升EMSA/Gel-Shift结合

1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如:NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等; 2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等; 3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原; 4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失; -1mM的PMSF，防止目的5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1 蛋白被降解; 6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%(v/v) 7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质; 8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间; 9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍(最高可6M)，尿素(最高可8M) 10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染组氨酸标签蛋白的纯化

那这几种技术要同时用吗？ChiP与EMSA的区别是什么呢？

多个核型多角体病毒 标记救援 反密码子摆动假说 棉铃虫核型多角体 代谢质粒 病毒附着蛋白 广泛宿主范围载体 实时PCR EMSA

不会是loading buffer 出问题沉淀堵孔了吧一般不会的哦。。。。我没有做过，，猜测猜测……

欧洲主流的保温壶都是用玻璃内胆的，玻璃内胆和市场中低端的玻璃内胆有以下区别 1、玻璃不能含重金属。 2、玻璃镀层须为纯银，加工不能使用石棉等危险物质。 3、 玻璃胆为人工制造，成本和耐用性大大提高。 4、人工制造的玻璃胆在内壁表层有许多不规则纹路和毛细微孔，饮品入内可以形成如紫砂壶相似原理的缓释氧化和保温的作用，因此人们喜欢直接用玻璃保温壶盛放咖啡和茶类饮品，而不是单纯的热水。 5、容量基本为1升至1.5升，设计原理是考虑到正常人3-5小时的饮料容量。避免‘老水"。 6、人工内胆对水中的重金属等杂质的吸附能力比不锈钢和机器玻璃胆有更好的表现，而且由于玻璃结晶自然形成，毛细孔弧度天然，更加容易清洗。 7、玻璃内胆无法和不锈钢内胆的强度相提并论，一般用于办公和居家使用。不锈钢内胆适合高强度和户外场合使用。 8、不锈钢内胆必须使用优质不锈钢，否则可能存在重金属或锈蚀的风险。

首先，你需要确定你的目的蛋白正确融合上了GST标签，建议先用anti-GST抗体对lysis上清做个western。当然如果你和你同学用的是同一个质粒的话，那么这一步就不必了。若标签没有问题，你在Flow Though里又可以在目标分子量大小处检到蛋白的话，那么出现这种情况只可能是glutathione、柱子以及buffer的问题。关注你所使用的GSH的保存条件、状态以确保没有被氧化；换一批Glutathione Sepharose 填料或用你同学用过的柱子试试；视情况对binding 的PH、盐浓度、DTT浓度做个优化 ，调整washing 及elution buffer glutathione 浓度。必要时甚至可以考虑更换缓冲体系。没有见到你的protocol所以不好更具体的说，但是需要强调的一点是，不要完全依赖protocol。不同的蛋白个性差异很大，同一个protocol做相同类型的不同的蛋白可能会得到完全不同的结果，因此很多时候对各个影响因素做若干水平的正交实验来确定一个符合实际需要的条件 是往往是必须的。

poly(dI:dC)（dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？ 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)（dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)（dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)（dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)（dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用...poly(dI:dC)（dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？ 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)（dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)（dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)（dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)（dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝胶迁移反应，它们会带有目的蛋白的结合位点。

一.Enjoyhot&cold冷暖相宜容器产品特有技术：EMSA高规格的多层晶钻隔热瓶胆 2层优质耐热玻璃/EDS-layers技术,全人工内胆制造。内胆内壁充分的极微小气穴，形成犹如紫砂原理的缓释效果，完美保持饮品原味2层纯银镀层，产生有效的热反射，安全无污染风险1层高真空，高效隔热一体成型 二．Enjoymobilelife怡享旅程器皿系列特有技术:专利的u201ePowerLoc“-Closure:单手按压式杯盖全拆卸清洁设计100%防漏高真空保温高标准选材工艺，全面符合欧盟儿童食品接触标准三．Freshnessguaranteed&organized易鲜生活储藏收纳系列特有技术：1．欧盟婴童食品接触安全材料工艺通过欧盟DINEN14350-2EU的严格要求，成为市场目前唯一通过此要求的食品保鲜容器。2.无缝一体成型密封系统l优势1:高密封压力，真正实现100%防漏。n大多数食物保存时间更长*.nEMSA独有的一体成型密封圈比普通双孔硅胶圈密封压力更大n蓝色胶圈与透明盒盖一体成型，不会剥落。l优势2:无缝，无细菌滋生空间n密封圈与盒体一体成型n加宽的密封设计，安全，方便清洗 n无缝，无细菌滋生的死角,100%无异味渗出l优势3:实用的细节设计，通过专业餐饮行业使用HACCP认证四．‘Prepare&servefreshness"易鲜生活餐厨工具特有技术l‘Turbo"加速，转速提高40%以上l‘Spacesaving"设计，节省空间70%l优良的选材和加工工艺，全面符合欧盟儿童食品安全标准l‘Allin1"整合设计，提供全面的餐厨解决方案五．‘Plants/flowerspresented&cared"多彩四季园艺养护特有技术l‘AQUA-COMFORT"自动供水技术l‘360spray"超细喷雾工艺l完整的色系搭配设计六．Esteras爱斯特拉户外园艺特有技术l‘AQUA-COMFORT"自动供水技术l超轻光纤喷涂技术lFreecare便捷养护设计lUVfree10年抗紫外工艺

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一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。扩展资料由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学 软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。同时，由于EMSA在体外不能模 拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。参考资料来源：百度百科-EMSA （凝胶迁移）

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

凝胶迁移实验1)什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。2)作这样的实验需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega公司的Riboprobe?/sup系统（a,b）（目录号P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素标记的RNA的体外合成，DNA5`末端标记系统（目录号U2010）用于制备DNA探针，结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage?/sup分析。3)凝胶迁移实验系统提供了什么试剂？Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA结合蛋白，系统可作为这类实验的 一种正对照。系统包括目的寡核苷酸，对照DNA结合蛋白，结合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。Core 系统（目录号E3050）包括含重组AP2蛋白（AP2抽提液）的大肠杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外，Core系统还含SP1同源寡核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液（5′），和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete系统（目录号E3300）含另外5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB,、NF-kB、 TFIID结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或在竞争实验中用作非特异性探针。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。4)成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（20ul）。为满足一般要求，结合缓冲液含4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油，0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？有各类dsDNA探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和这些引物序列的出处。转录调控因子探针---------------------------------------探针名 目录号 序列（上链） 序列的出处Sp1 E3231,E3232 5`-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3` SV40启动子（1）AP1 E3201 E3202 5`-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3` 胶原酶基因TRE（2）AP2 E3211 E3212 5`-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3`人金属硫堇II a(3)基因NF-kB E3291, E3292, 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3`鼠Igk轻链基因（4）Oct1 E3241 E3242 5`-TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3` Ig重链基因（5）CREB E3281 E3282 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3`大鼠生长激素抑制基因（6）TFIID E3221 E3222 5`-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3`belta-1球蛋白启动子只列出了上链的序列，探针是双链，下链序列和上链序列配对。黑体字表明序列来源于指定的基因序列，转录调控因子结合的序列用下线表明。一般而言，周围的核苷酸是任意。6)在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要因素？目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp）,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。7)用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时，每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子，包括识别的同源序列，因子的大小，特定的结合条件，以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目。1．AP1：AP1（激活蛋白1）是一个转录调节因子，它结合的同源序列为5`-TGAGTCA-3`。当基因的启动子区域存在AP1的结合位点时，这些基因可以被诱导，比如用佛波酯可诱导蛋白激酶C（2，7）。在细胞中，AP1形成c-Jun或Jun相关蛋白的同聚双体，或者形成c-Jun或Jun相关蛋白和c-Fos或Fos相关抗原（Fras）的异源双体。Fos蛋白自身不能形成同聚双体，并不能单独和AP1结合位点结合。c-Jun蛋白是一个40kDa的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。在HeLa细胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚双体。在凝胶迁移实验中，形成一个特异的复合物。当作凝胶迁移实验测定AP1的活力时，除了基本的溶液组分外，应将0.01mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到结合缓冲液中。如用纯化的蛋白，则用1-2ug的蛋白来检测迁移复合物。2．AP2：AP2是一个转录调节因子，可分别作为TPA-和cAMP诱导因子（10）。它是一个52 kDa的蛋白，识别的同源序列为5`-CCCCAGGC-3`或5`-GCCNNGGC-3`（3）。这个因子对视黄酸特别敏感，可能在形态发生中起着重要作用。HeLa细胞核抽提物和AP2同源DNA探针形成一个特定的复合物。用纯化的蛋白作凝胶迁移实验时，应用20-50ng的蛋白。3．CREB：CREB是一个37 kDa的转录调节因子，对cAMP应答，识别5`-T（G/T）ACGTCA-3`DNA同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉链结构而形成同聚双体，相关的基本结构域和c-JunDNA结合结构域同源。当用HeLa细胞核抽提物时，能和CREB同源序列形成一个复合物。4．NF-kB：NF-kB最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-kB和IkB的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49（也可称为p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75单体起反式激活作用。p50，p49（p52）单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应（14）。p49和p50也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作NF-kB的凝胶迁移实验时，在20ul的反应体积中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49，p50，p65的细胞中，可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。下列试剂可加强NF-kB在体外的结合：mM的GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子，ng的Co+3(NH3)6（12）。5．OCT1：OCT1是OCT转录调节因子家簇中的一员，显然在哺乳细胞中存在比较广泛（5）。POU结构域包括POU-box和Homeo结构域。当用HeLa细胞核抽提物时，可检测到一个与OCT1同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。6．SP1：SP1是一个O-糖基化的转录调节因子，它识别10个核苷酸长度的同源序列5`-GGGGCGGGGC-3`（1）。核心识别序列是5`-GGGGCGGG-3`。同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40的早期启动子就是一个例子，它是第一个可以结合SP1的启动子。根据糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa细胞核抽提物与SP1同源探针形成特异的凝胶迁移复合物。7．TFIID/TFIIB：TFIID和TFIIB是基本的转录调节因子，参与RNA聚合酶II启动子的基本的转录（16）。TFIID与真核启动子的TATA区域形成特异的DNA结合。TFIID由几个蛋白组成，而其中的TATA区域结合蛋白（TBP），参与TATA序列的结合。TFIID的其他的蛋白组分被称为TBP-相关因子（TAFs）。用TFIID探针寡核苷酸和HeLa细胞核抽提物，可得到一个微弱的凝胶迁移带，但很难确定为是TFIID序列特异凝胶迁移复合物。纯化的重组的TBP很难作凝胶迁移实验，这部分是由于TBP存在很强的正电荷，导致TBP/DNA复合物很难进入凝胶。纯化的TBP形成二聚体后不能结合DNA（17）。因此形成的二聚体可参与DNA结合。TFIIB不单独与DNA结合，但与TFIID结合后增强它与DNA的结合。TFIIB与预启动复合物结合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF结合到转录启始区。故TFIIB在预启动复合物的形成中有重要作用。当用纯化的TFIID作凝胶迁移实验时，poly(dI-dC)不用加入结合反应中。结合缓冲液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。对TFIID的凝胶结合实验中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，凝胶组分是：0.5′TBE, 6%聚丙烯酰胺凝胶(19:1丙烯酰胺:双叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 电泳缓冲液组分是：0.5′TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。当研究含TFIID和TFIIB的复合物时，应从结合缓冲液，凝胶，和电泳缓冲液中去除MgCl2。这些是一般的要求，用不同的细胞抽提物和TFIID、TFIIB形成复合物作凝胶迁移实验时，应对多种因素进行优化以达到理想的条件。8)在一次凝胶迁移实验中，用多少量的蛋白质或抽提物，和标记的DNA探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白：DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白形成特异的复合物。所加入反应的探针的量是50，000-200，000cpm32P-标记的探针（高特异活性），反应体积为1-5ul。这相当于10-50fmoles的DNA探针。探针应保存在-20oC以防止降解，在合成或标记后1-2个星期内必需使用。无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。9)能用体外翻译法制备目的蛋白质吗？Promega没对所有的转录调节因子作这类测试。一般，用麦胚抽提物作哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白的体外翻译，兔网织红细胞溶裂解液可能含有内源哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白。但TNT？/sup>兔网织细胞溶解液系统（a,b,c,d）与TranscendTM 生物素标记的tRNA(目录号E3201)一同使用，翻译了转录调节因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目录号E3201）产生的迁移效果和重组的AP1相同（18）。TNT？/sup>T7偶联的麦胚抽提物（b,c,d,e）在体外翻译了c-Rel。这一蛋白特异地使免疫球蛋白k轻链增强子探针产生迁移。在c-Rel结合反应中加入体外翻译的MAD-3（IkB家簇中一员）可干扰其相互作用。10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝胶迁移反应，它们会带有目的蛋白的结合位点。11)用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%（30：1丙烯酰胺：双叉），在特定条件下可用高或低的浓度。PH, 聚丙烯酰胺的浓度, 丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺的比会影响复合物在凝胶中的迁移。大多数蛋白用10-15伏的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压（30-35伏的电压），电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的，无沉淀。低的离子强度和丙烯酰胺基质的`箱子效果`有助于复合物的稳定。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物（Metaphor?/sup/agarose）。12)如何在一个特定的复合物中确定一个蛋白质的存在？部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，但有一些方法作这方面的研究。如有目的蛋白的抗体，可进行超迁移实验，抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。增量的抗体加入到结合反应中。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体结合后，再加入探针。取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度的减少。在大多数实验中，应对抗体作滴定，先使抗体：蛋白的摩尔比为1：1，然后应需要增加抗体的量。当有纯化的蛋白时，可用它们和实验的带型迁移复合物比较。除超迁移实验外，复合物中蛋白的特征也可用UV交联和标记转移来分析。在均质标记的探针和细胞核抽提物保温后，用UV照射使复合物交联，随后用DNA酶降解未保护的探针。需用均质标记的探针，因DNA酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离，干燥，放射自显影。结合蛋白的分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的蛋白的抗体对复合物作Western印迹分析（20）。如一个蛋白和DNA探针的特定序列结合，可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸，以及突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位点改变来研究复合物的形成。参考资料1. Briggs M R et al 1986 Science 234, 472. Lee W et al 1986 Cell 49, 7413. Williams T et al 1989 Genes Dev 2, 15574. Sen R and Baltimore D 1986 Cell 46, 7055. Parlsow T G et al 1984 Proc Natl Acad Sci USA 81, 26506. Montminy M R et al 1986 Proc Natl Acad Sci USA 83, 66827. Angel P et al 1987 Cell 49, 7298. Chiu R et al 1988 Cell 54, 5419. Rauscher F J et al 1988 Cell 52,47110. Imagawa M et al 1987 Cell 51, 25111. Berkowitz L A and Gilman M Z 1990 Proc Natl Acad Sci USA 87, 525812. Baeuerle P A 1991 Biochim Biophys Acta 1071, 6313. Duckett C S et al 1993 Mol Cell Biol 13, 131514. Urban M B et al 1991 EMBO J 10(7), 181715. Dynan W S and Tjian R 1983 Cell 35, 7916. Peterson M G et al 1990 Science 248, 165217. Coleman R A et al 1995 J Biol Chem 270, 1384218. Beckler G and Hurst

单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA,但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到.

1. 避免缓冲液高浓度电供体基团比:NH4甘氨酸精氨酸Tris等等;2. 各种缓冲液能强螯合剂EDTAEGTA等等;3. 各种缓冲液能高浓度强原剂比DTT防止二价Ni原; 4. 能含离型垢剂比SDS防止Ni流失;-1mMPMSF防止目5. 破碎细胞候建议加入蛋白酶抑制剂比0.1蛋白降解;6. 缓冲液加入甘油防止蛋白间由于疏水相互作用发聚集沉淀甘油浓度高达50%(v/v)7. 应避免含碳酸氢钠柠檬酸等物质;8. 缓冲液NaCl浓度应300mM2M间;9. 加入变性剂促溶盐酸胍(高6M)尿素(高8M) 10.加入非离型垢剂TritonTweenNP40等高2%减少背景蛋白污染除核酸污染组氨酸标签蛋白纯化没有意义建议自己下去查查资料

1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如:NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等;2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等;3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原; 4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失;-1mM的PMSF，防止目的5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1蛋白被降解;6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%(v/v)7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质;8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间;9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍(最高可6M)，尿素(最高可8M) 10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染组氨酸标签蛋白的纯化感觉这样的提问没有意义建议自己下去查查资料

本名:汪东成 生日:1981/8/24 星座:处女座 学历:复兴美工"广设科" 身高:"180" 演出经历: ☆☆ MTV☆☆ MAKIYO"还给你"MTV 张惠妹"记得"MTV (带头巾搬货的那个) 梁静如"分手快乐"合唱版 ☆☆CF☆☆ 多喝水cf"躺在浴缸篇" 有氏没氏非常茶饮料 来一客泡面"甩尾篇" 台新银行u be卡"日本泡汤篇" MOTOROLA好礼大方送"taxi篇" 立顿奶茶"破了比较好篇" 新光人寿"美丽人生篇" 爱之味鲜采蕃茄汁"保时捷篇" ☆☆平面☆☆ "木野直人&村明秀"服装代言人...已经当了三季喔! ps在很多百货公司都可以看得到,譬如:sogo,京华城,依蝶,西门诚品等... ☆☆ 戏剧☆☆ 偶像剧"听笨金鱼唱歌" 偶像剧"恶作剧之吻" 偶像剧"终极一班" 本名：辰亦儒 小名:：陈奕儒 英文名：Calvin (基本上朋友都这么叫我) 身高：184 cm 体重：65 kg 生日：1980／11／10 星座：天蝎座 学历：建中 温哥华Simon Fraser University 大学 主修经济维多利亚 University of Victoria 硕士 主修经济 血型： A型 鞋号：US 10.5 号 三围： 37, 31, 36 家庭成员：爸爸 妈妈 一个姐姐 喜欢的颜色：蓝色 白色 兴趣：健身 网球 唱歌 个性： 风趣幽默 专长： 反应很快 嘿嘿 歌声如何： 还不赖 自认中上 哈 眞的啦 录音师也这么说^^ 近视：小时是电视儿童 所以 两眼都550 @@ 头发：微卷 以前超不爱 超限慕直发的人 但后来发现卷发其实好做造型 也不赖 哈 口头禅：没啥特别的口头禅ㄟ 英文能力：国外研究所的能力搂 拍过的MV：拍摄当届创作歌曲选拔冠军"难以抗拒" 的音乐录影带 拍过的广告：一堆加拿大温哥华阳光男孩公益活动的广告 大概有5支左右吧 欣赏的女生类型：气质型 家人对calvin进演艺圈的看法：书读了那么多 给我跑去演艺圈 贞士气死人 哈 所以我需要你们的大力只持 交出好成绩给爸妈看 证明给他们看!! 平常喜欢：跟好友聚在一起 做什么都可以 因为我很重视友谊 喜欢电影种类：好看的话 不管是动作 喜剧 文艺爱情 惊悚 我都爱 最爱的电影：很多ㄟ 不过我很喜欢 妮可拉斯凯吉演的任何电影 他的演技真是没话说 喜欢的歌手： 不如说是音乐种类吧 Hip Pop and R&B 喜欢的女演员： 喜欢的男演员：梁朝伟 吴镇宇 喜欢的日本艺人：木村 帅 喜欢的漫画：男生爱看的 譬如 七龙珠 灌篮高手 神型太保 喜欢看哪类型的小说： 最想去的国家：加拿大 像是我第2个家 毕竟我呆了7年 我很想环游世界 喜欢不同的文化 喜欢的音乐类型：Hip Pop and R&B 喜欢什么动物： 狗 超爱 之前加拿大养了两只比熊 不知道你们只不知道这个品种 有点像马尔季斯 但比马尔季斯大一点 喜欢的食物：Japanese Food and Western food..Junk food..哈 喜欢看书或上书店：以前在国外认为在书店喝咖啡看书是种享受 很爱忙里偷闲的感觉 嘿 喜欢购物：超爱 基本上 我逛街可超像女生 哈 跟我逛街的男生都很受不了 觉得我超会逛 害怕什么事物： 害怕的事还好 但不喜欢伤心的事 譬如失恋 或跟朋友吵架这类的 平常的穿衣style：两极化 有时很休闲 有时爱穿很正式耍帅 哈 印象最深刻的事：7年前一个人独自上加拿大生活 一直一个人过了7年 接过哪一件最辛苦的CASE：还好ㄟ 不过夏天拍戏 真是热热热 希望能和所有的Fans共同做什么事：多点见面会 多认识你们 我会好好努力记住你们的名字 你们只要见到我 我较不出你的名字 就再提醒我一次 直到我记住为止 哈 基本上我记性很好的喔 当艺人前从事过什么工作： 都在加拿大念书 念研究所当过学校大学助教 喜欢哪一类的书： 初恋和初吻几岁：16岁 高一 谈过几次恋爱：好私人喔 不过不多啦 真的 5次以下 可以了吧 哈 讨厌什么样的人：就是两面人搂 讨厌什么昆虫或动物： 最糗的事： 最痛苦的事： 梦想： 演艺圈闯出一番好成绩 这是我目前最大的愿望吧 对未来的期望： calvin名言： Shakespear says: To be or not to be, that"s a question..ha ha 本名：吴庚霖 艺名：炎亚纶 匿称：阿布 生日：1985/11/20 星座：天蝎座 血型：O 身高：177 体重：60 学历:文化大学新闻系 语言：国语、英语 嗜好：篮球、跳舞、唱歌、交朋友、爱搞怪 个性：多变 但大部分是话少却好相处 三围：胸围忘ㄌ 28 36 身体状况：轻微气? 专长：钢琴长笛 篮球 最喜欢的团体：信乐团 最喜欢的男演员：刘德华 最喜欢的女演员：林依晨 最喜欢的男歌手：哈林、林俊杰 最喜欢的女歌手：林凡、梁静茹 最想去的国家：都想去^^ 最喜欢的音乐类型：soul rock pop R&B hard rock jaz 最喜欢什么东西？有心意ㄉ东西 最喜欢的颜色：绿色蓝色黄色黑色 欣赏的女生类型：个性比较重要罗 让你印象最难忘的事：初恋的心碎... 最糗的事：ㄟ...怎么会有糗事发生在我身上勒 谈过几次恋爱？哈哈蛮多次ㄉ 梦想：现在正在走ㄉ未来将达成ㄉ就是我ㄉ梦想 想对家族成员说的话：你们每ㄍ人都很贴心也很可爱 我们要一起加油 考上大学...(不是啦) 你们每ㄍ人都要好好照顾身体 一定每天都要健健康康!! 真ㄉ!! 不管到哪里心都与你们相系 寄东西给你要寄到哪？ 110 台北市信义区嘉兴街311号三楼 炎亚纶收 §演艺经历: 戏剧- 2004 安室爱美惠 2005 恶作剧之吻 2005 终极一班 团体- 2005 飞轮海 比赛- 2004 新光三越第二届阳光男孩选拔台北区(初赛) 姓名：吴尊 生 日 1980/10 /10 身 高 182 cm 体 重 73 kg 鞋 号 10 号 胸 围 40 腰 围 31 臀 围 38 故 乡 汶 莱 学校：RMIT大学，澳洲（RMIT UNIVERSITY, AUSTRALIA (BACHELOR OF BUSINESS IN BUSINESS ADMINISTRATION） 个性：害羞,见忘，事业为重。 嗜好： 打篮球，健身，看书，听音乐,看电影,吃,煮饭和旅行。 喜欢的颜色：看情况… 喜欢的食物： 我很爱吃,除了油腻的食物我甚么都吃。 喜欢的饮料：无酒精的鸡尾酒饮料 MOCKTAIL 喜欢的音乐： 看心情 喜欢的地方： 纽约 最想去的城市： 纽约 喜欢的电影： 英雄本色 最喜欢的季节： 春 喜欢的卡通人物： 超人 最喜欢的花/花语：百合 几岁初恋：16岁 喜欢异性类型： 对我而言，最重要的昰感觉。 最讨厌的事情：失去我身边最重要的人 最大的愿望： 在生命里做个好与事业有成的人 做过最难忘的事情： 在照顾去世前的妈妈 做过最后悔的事情： 在妈妈去世前没花足够的时间在她的身边 做过最有勇气的事情： 在台湾继续追求我在演艺圈的事业 吴 尊 在 汶 莱 时 是 健 身 教 练 以 前 为 伊 林 的 模 特 儿 ， 现 为 飞 轮 海 团 员 之 一姓名：汪东城性别：男原名：汪东成生日：1981年8年24日星座：处女座国籍：中国地域：港台身高：180cm嗜好：运动、音乐星路历程： 汪东城 ——《终极一班》里冲动热血的汪大东。模特儿身份出道，演出多部偶像剧，《恶作剧之吻》里痴情的阿金让他初尝走红滋味，《终极一班》收视告捷后更是声势最为看涨的领军成员。孝顺敦厚的他一肩扛起家庭重担，成为他从模特儿到演员进而歌手不断向前的打拼动力，强烈的自我风格创造出独有的“东式酷男”style，热爱摇滚的内在更使其歌声别具特色，不造作的率直单纯和努力上游的认真精神，架构出汪东城浑然天成新好男儿的热情“酷劲”!! 其它：口头禅：真的还假的 最糗大的事：逛街时衣服穿反 最难忘的事情：高中毕业典礼 喜欢的颜色：天空色、大地色 喜欢的艺人：HIDE 喜欢听到的话：有气质 喜欢吃的东西：只要能吃的都可以 未来的目标：人见人爱的艺人 人生以服务为目的，服务众人 外表颇酷，但自认内心既狂野热情又搞笑 喜欢的颜色：天空色、大地色 喜欢的艺人：HIDE 喜欢听到的话：有气质 喜欢吃的东西：只要能吃的都可以 目前为可米飞轮海(Fahrenheit)成员 其他成员为辰亦儒、炎亚纶、吴尊. 姓名：吴尊性别：男原名： 生日：10月10日1980年10月10日星座：天秤座国籍：文莱地域：港台身高：183cm血型：B型嗜好：打篮球 健身 看书 听音乐 看电影 吃 煮饭和旅行职业：演员 歌手 模特生平介绍： 吴尊——《终极一班》里的KO榜最强高手及《东方茱丽叶》里深情帅气的纪风亮。来自东南亚神秘的国度“文莱”，举手投足间尽是贵族般的神秘气质。近乎完美的五官与健美的身材，一出道就获邀担任偶像剧男主角。由于语言文化的差异，吴尊在戏剧与歌唱上需要付出比别人多好几倍的努力，养成他耐心倾听和思乡情重也造就出吴尊深情踏实的个性，完美的外表更是叫人“神往”!! 其它：喜欢的颜色：看情况… 喜欢的食物： 我很爱吃,除了油腻的食物我甚麼都吃 喜欢的饮料：无酒精的鸡尾酒饮料 MOCKTAIL 喜欢的音乐： 看心情 喜欢的地方： 纽约 最想去的城市： 纽约 喜欢的电影： 英雄本色 最喜欢的季节： 春 喜欢的卡通人物： 超人 最喜欢的花/花语：百合 几岁初恋：16岁 喜欢异性类型： 对我而言，最重要的昰感觉 最讨厌的事情：失去我身边最重要的人 最大的愿望： 在生命里做个好与事业有成的人 做过最难忘的事情： 在照顾去世前的妈妈 做过最后悔的事情： 在妈妈去世前没花足够的时间在她的身边 做过最有勇气的事情： 在台湾继续追求我在演艺圈的事业 团体:飞轮海吴尊——《终极一班》里的KO榜最强高手及《东方茱丽叶》里深情帅气的纪风亮。来自东南亚神秘的国度“文莱”，举手投足间尽是贵族般的神秘气质。近乎完美的五官与健美的身材，一出道就获邀担任偶像剧男主角。由于语言文化的差异，吴尊在戏剧与歌唱上需要付出比别人多好几倍的……姓名：炎亚纶性别：男原名：吴庚霖生日：1985年11月20日星座：天蝎座国籍：中国地域：港台身高：177cm血型：O型嗜好：篮球、跳舞、唱歌、交朋友、爱搞怪星路历程： 炎亚纶——《终极一班》里外冷内热的丁小雨。文化大学新闻系资优生，头脑聪明，拥有犹如漫画美形男的外表，一个眼神就能掳获你的心。凡事态度认真要求第一，优越唱腔与弹琴技巧让人折服。外型看来沉静，其实内心热情洋溢。最年轻的成员，因此不多话和稚气的外型营造出炎亚纶羞涩沉静让人“情迷”特质。其它：学历:文化大学新闻系 语言：国语、英语 个性：多变 但大部分是话少却好相处 身体状况：轻微气喘 专长：钢琴长笛 篮球 最喜欢的团体：信乐团 最喜欢的男演员：刘德华 最喜欢的女演员：林依晨 最喜欢的男歌手：哈林、林俊杰 最喜欢的女歌手：林凡、梁静茹 最想去的国家：都想去^^ 最喜欢的音乐类型：soul rock pop R&B hard rock jaz 最喜欢什麼东西？有心意的东西 最喜欢的颜色：绿色蓝色黄色黑色 欣赏的女生类型：个性比较重要罗 让你印象最难忘的事：初恋的心碎... 最糗的事：...怎么会有糗事发生在我身上勒 姓名：辰亦儒性别：男原名：英文名：Calvin生日：1980年11月10日星座：天蝎座国籍：中国地域：港台身高：184cm血型：A型星路历程： 辰亦儒——《终极一班》里气质优雅的亚瑟王。为自我提升国际观和外语能力决定远赴加拿大就学，自小喜爱阅读、追求知识，总是能源源不绝地说出许多事物典故，是“飞轮海”里语言能力优秀与最具有人文气质的成员。曾获选为加拿大“Sunshine Boyz 2004”冠军及担任过加拿大的暖流大使。态度谦和、总是带着笑容，善良的心地让辰亦儒自然散发出「帅气」优雅的气质?!!

摘要：光纤连接器就是光纤与光纤之间的连接器，它也可以称为光纤连接器。光纤连接器的质量直接影响到我们的网络信号好坏，因此该类产品对光学性能、抗拉强度、温度都有明确的性能要求。市面上的光纤快速连接器种类有很多，常见的有FC光纤连接器、SC型光纤连接器、ST型光纤连接器、LC型光纤连接器等等，接下来就和小编一起来看看吧。一、光纤快速连接器的种类有哪些1、FC光纤连接器这种连接器最早是由日本NTT研制。FC是FerruleConnector的缩写，表明其外部加强方式是采用金属套，紧固方式为螺丝扣。最早，FC类型的连接器，采用的陶瓷插针的对接端面是平面接触方式（FC）。此类连接器结构简单，操作方便，制作容易，但光纤端面对微尘较为敏感，且容易产生菲涅尔反射，提高回波损耗性能较为困难。后来，对该类型连接器做了改进，采用对接端面呈球面的插针（PC），而外部结构没有改变，使得插入损耗和回波损耗性能有了较大幅度的提高。2、SC型光纤连接器这是一种由日本NTT公司开发的光纤连接器。其外壳呈矩形，所采用的插针与耦合套筒的结构尺寸与FC型完全相同，其中插针的端面多采用PC或APC型研磨方式；紧固方式是采用插拔销闩式，不需旋转。此类连接器价格低廉，插拔操作方便，介入损耗波动小，抗压强度较高，安装密度高（路由器交换机上用的最多）。3、ST型光纤连接器ST型光纤跳线：常用于光纤配线架，外壳呈圆形，紧固方式为螺丝扣。(对于10base-F连接来说，连接器通常是ST类型。常用于光纤配线架）。4、LC型光纤连接器LC型连接器是著名Bell研究所研究开发出来的，采用操作方便的模块化插孔（RJ）闩锁机理制成。其所采用的插针和套筒的尺寸是普通SC、FC等所用尺寸的一半，为1.25mm。这样可以提高光配线架中光纤连接器的密度。目前，在单模SFF方面，LC类型的连接器实际已经占据了主导地位，在多模方面的应用也增长迅速。5、双锥型连接器这类光纤连接器中最有代表性的产品由美国贝尔实验室开发研制，它由两个经精密模压成形的端头呈截头圆锥形的圆筒插头和一个内部装有双锥形塑料套筒的耦合组件组成。6、DIN4型光纤连接器这是一种由德国开发的连接器。这种连接器采用的插针和耦合套筒的结构尺寸与FC型相同，端面处理采用PC研磨方式。与FC型连接器相比，其结构要复杂一些，内部金属结构中有控制压力的弹簧，可以避免因插接压力过大而损伤端面。另外，这种连接器的机械精度较高，因而介入损耗值较小。7、MT-RJ型连接器MT-RJ起步于NTT开发的MT连接器，带有与RJ-45型LAN电连接器相同的闩锁机构，通过安装于小型套管两侧的导向销对准光纤，为便于与光收发信机相连，连接器端面光纤为双芯（间隔0.75mm）排列设计，是主要用于数据传输的下一代高密度光连接器。8、MU型连接器MU连接器是以目前使用最多的SC型连接器为基础，由NTT研制开发出来的世界上最小的单芯光纤连接器，该连接器采用1.25mm直径的套管和自保持机构，其优势在于能实现高密度安装。利用MU的l.25mm直径的套管，NTT已经开发了MU连接器的系列。它们有用于光缆连接的插座型光连接器（MU－A系列），具有自保持机构的底板连接器（MU－B系列）以及用于连接LD／PD模块与插头的简化插座（MU-SR系列）等。随着光纤网络向更大带宽更大容量方向的迅速发展和DWDM技术的广泛应用，对MU型连接器的需求也将迅速增长。二、光纤连接器的性能要求是什么1、光学性能对于光纤连接器的光性能方面的要求，主要是插入损耗和回波损耗这两个最基本的参数。插入损耗即连接损耗，是指因连接器的导入而引起的链路有效光功率的损耗。插入损耗越小越好，一般要求应不大于0.5dB。回波损耗是指连接器对链路光功率反射的抑制能力，其典型值应不小于25dB。实际应用的连接器，插针表面经过了专门的抛光处理，可以使回波损耗更大，一般不低于45dB。2、互换性、重复性光纤连接器是通用的无源器件，对于同一类型的光纤连接器，一般都可以任意组合使用、并可以重复多次使用，由此而导入的附加损耗一般都在小于0.2dB的范围内。3、抗拉强度对于做好的光纤连接器，一般要求其抗拉强度应不低于40N。4、温度一般要求，光纤连接器必须在-40℃~+70℃的温度下能够正常使用。5、插拔次数

歌曲名:Midnight (1995 Digital Remaster)歌手:The Shadows专辑:The Shadows Complete Singles As & Bs: 21 Years At The TopRed Hot Chili Peppers - MidnightThings will never be the sameStill I"m awfully glad I cameResonating in the shape of things to comeNever waiting when I know there"s only oneMessed it up but rest assuredNo one ever thinks they"re curedJust a minute while I reinvent myselfMake it up and then I take it off the shelfOver the laws of lightOver the moon by midnightLet"s do it all this timeEveryone wishing well we goEveryone knows anything goesWe are the lotus kidsBetter take note of thisFor the storyThe rising moon is on the shineThe blood of scorpios a nineLike the fear that"s in the eyes of every doeSay it now cause John and Jane would like to knowIs it safe inside your headSongs to serenade the deadAll along I said I know no enemiesMix it up until there are no pedigreesEnter the shadow show andEnter the rolling tideOver your ocean so wideLet"s do it all this timeEveryone wishing well we gohttp://music.baidu.com/song/2929271

JohnMcLarenJohnMcLaren，演员，出演过《TheFourJustMen》，《IntenttoKill》，《ArmchairTheatre》等。外文名：JohnMcLaren职业：演员代表作品：《TheFourJustMen》，《IntenttoKill》，《ArmchairTheatre》曾合作人物：MarkBaker

使用英语趣配音，配音练习，提高口语

怎么映射内网。。你是怎么解决的。也是想用来游戏的。我是NTT光，好像就有一个回线。我没有配路由器

歌曲名:Midnight 台北歌手:赵咏华专辑:我的爱 我的梦 我的家赵咏华 Midnight台北词/曲:郑华娟 编:何朝元夜幕刚落 整个生活陷入一片灯火今天我们勇敢从忙碌中逃脱如果沉默 多情会是枷锁从来没有过 单独你我走上这条夜的公路 心情起伏你说想从高处回首城市的面目星光夜雾 山风迎面吹拂爱情的温度 在我手中 被你握住Midnight台北 你是如此的美当爱吻上我的脸你可听见我的泪Midnight台北 心已不再沉睡任凭夜凉如水 让我尽情享受爱的包围http://music.baidu.com/song/2126607

随着经济的发展，让燃气热水器不断代替普通的热水器，使用燃气热水器的家庭越来越多。即使它那么受人类的欢迎，还是有很多朋友对它有安全方面的疑惑，都会问燃气热水器怎么样？到底好不好？接下来，小编就为大家讲讲燃气热水器的相关知识，看看燃气热水器到底好不好！何为燃气热水器燃气热水器，是指以燃气作为燃料，通过燃烧加热方式将热量传递到流经热交换器的冷水中以达到制备热水的目的的一种燃气用具。主要是由阀体总成、主燃烧器、小火燃烧器、热交换器、安全装置等组成。（还包括烟道式热水器烟道、强排式热水器的强排装置。燃气热水器的基本工作原理是冷水进入热水器，流经水气联动阀体在流动水的一定压力差值作用下，推动水气联动阀门，并同时推动直流电源微动开关将电源接通并启动脉冲点火器。燃气热水器怎么样一、燃气热水器优点1、燃气热水器加热速度迅速，即使多人使用，也无需等待，且使用过程温度稳定，不会像电热水器那样逐渐下降；2、因为燃气热水器加速快，无需设置储水器，因此不会产生水垢；3、燃气热水器使用成本较低；4、购买成本低，几百块就有交易了。二、燃气热水器缺点1、安装较为麻烦，不仅要接燃气管，还要接水管、电插头、排气管等，还需要煤气公司或产品售后员工上门安装；2、不环保，不仅使用燃气，还会向空气中排放二氧化碳；3、燃气热水器使用时间长，会出现爆燃、燃气泄露等危险。七大要点告诉您如何选购燃气热水器1、首先考虑应按照使用燃气的种类选购每种燃气具都有适用燃气具种类的标识，一定要选购与自己家中使用的燃气种类相同的产品。目前我国燃气的气源主要有三种：天然气、液化石油气、人工煤气。设计热水器时是根据气源的特性来决定的，由于三种气源成分不同，所以设计制造的燃烧器等部件尺寸也不相同。一种热水器一般只能适用于一种气源，广大客户在选择燃气热水器时要向专业人员询问清楚，选择与气源相适应的热水器。认清标志：人工煤气JSR，液化石油气JSY，天然气JST，以防弄错。2、使用管道供气的用户在选购燃气热水器时，要保证燃气热水器的耗气量不大于家中燃气表的流量，使用钢瓶液化石油气的用户请选用相适应的减压阀，否则会造成燃气的供应不足，不能充分发挥热水器的供热水能力。3、慎重选择低廉的燃气热水器现在市场上有很多燃气热水器价格在八九百元，甚至更低。实际上，燃烧器、风机、气阀、水阀、点火系统、控制板加上机体本身，如果只用质量一般的材料，成本都会在千元以上，看来如果盲目图便宜并不是明智的选择。同时要注意购买厂家在当地有售后服务的产品。4、购买燃气热水器，要考虑安全装置是否齐备可靠，如熄火保护、水过压保护、防干烧安全保护、防冻保护等。建议选择带智能防冻功能的方式，而不是通过放水阀手工进行放水的防冻方式。前些年许多家庭的燃气热水器不带智能防冻功能，机器会因为洗澡后没有手工放水导致被冻漏，严重的还会泡坏地板，造成不必要的损失。5、热水器每分钟的出水量有大有小所以热水器有6升、8升、10升等规格之分。大流量的热水器适合人口多和没有暖气的家庭，小流量热水器则相反。如您住在五楼以上高层，最好选择低水压启动的燃气热水器。6、至少要选择强排燃气热水器普通烟道燃气热水器废气的排放方式安装要求高，绝大多数居民都未按规范安装。而强排燃气热水器的烟道容易达到规范要求。为了便于操作，带大屏幕背光液晶视窗及数字触摸式按键的产品也是不错的选择。在内部配置上，现在市场上较先进的是采用电子比例阀，智能调节燃烧功率，同时配置无级变频强鼓风机的机器，能最大限度地提高燃烧效率，节省燃气。为了能让恒温效果更佳，高精度的电子水温与水流量传感器等装置也很重要。目前市场上最优质的热交换器是采用环保型无氧铜热交换器，换热效率更高，寿命更长。在消费者很关心的安全性能方面，应该选择带微电脑的全程安全自检系统。如果产品可以配置非常精致小巧的数字线控器，而且本机上的操作器也可移出而作为线控器安装在浴室里，就应该是强排产品中的佳作。7、建议选择强制平衡式虽然价格偏高，但是绝对安全。该类热水器通过双层同轴烟道管，燃烧所需的空气强制吸自室外，同时废气强制排至室外，无废气泄漏室内的可能，且不消耗室内的空气。另外，由于采用双层烟道管，当来自室外的空气进入机内时，被排往室外的热废气预加热，起到了回收能源的功效。个别顶级品牌内置高性能智能芯片的微电脑控制器监控水流量和进出水温度，快速达到恒定温度出水，无较大水温波动现象。除此之外，性能优异的热水器在工作时，智能芯片不间断“聪明”记忆，使机器凭记忆以最佳工作参数运行，迅速精确地达到设定恒温出水，极大了缩短了热水器升温与恒定水温的时间，避免了水与燃气的浪费。

分类: 体育/运动 解析: 麦克拉伦车队是由Bruce McLaren所创立的，所以就用他的名字McLaren命名的。现在的中文名改称“迈凯轮”不过我还是觉得这个名字也没有给McLaren带来好运，还是习惯叫它麦克拉伦

化学反应 铁粉遇到空气

是：atmidnight释义：在午夜， 在半夜，午夜，午夜时短语：AtOneMidnight 一天夜里AtAboutMidnight 中约在半夜atthemidnight 在午夜例句：She stole out ofthe house at midnight. 她在半夜悄悄离开了家。《21世纪大英汉词典》They startedofftoNormandie at midnight. 他们在午夜踏上了开赴诺曼底的征程。www.yinghanhuyi.comThey arrivedin Beijing at midnight and checked into Beijing Hotel. 他们于午夜抵达北京并登记住进北京饭店。

英格兰的，前英格兰国家队主帅，08年在欧锦赛预选赛主场负于克罗地亚的比赛后下课。也是前米德尔斯堡主帅。带领米德尔斯堡获得了联盟杯亚军。

歌曲名:Midnight (2008 Digital Remaster)歌手:Yazoo专辑:Upstairs At Erics (Remastered)Midnightartist: Green Pitchalbum:"Ace of Hearts"BillyI can hear you singseems almost silly nowlike a magnetic fieldswitched on somehowI think it"s safe to sayI"ll watch his chest hair turning greyand as the stairs alignthe most unfortunate of signsthat led me to your armslove"s not overratednot this timeit"s a magnetic fieldswitched on somehowI think it"s safe to sayI"ll watch his chest hair turning greyat night when I"m aloneI know he will be coming homeperhaps he"ll cook a midnight mealand I"ll smile to let him know I feela different way of still the sameI think it"s safe to sayI"ll watch his chest hair turning greyand as the stairs alignthe most unfortunate of signsthat led me to your armsit"s a magnetic fieldswitched on somehowhttp://music.baidu.com/song/2559533

简单来说，罗茨风机由两个相互啮合的转子组成，两个叶轮旋转时，变压腔会形成吐气和吸气的变化，使空气从入口进入罗茨风机内部，随着转子旋转被压缩，终从出口处排出罗茨风机。罗茨风机具有结构简单，无油无污染，可靠性高等特点，因此广泛应用于空气输送、污水曝气、水产养殖增氧等行业领域里。

辰亦儒本名：辰亦儒小名:：陈奕儒英文名：Calvin (基本上朋友都这麼叫我)身高：184 cm体重：65 kg生日：1980／11／10星座：天蝎座学历：建中 温哥华Simon Fraser University 大学 主修经济维多利亚 Universityof Victoria 硕士 主修经济血型： A型家庭成员：爸爸 妈妈 一个姐姐喜欢的颜色：蓝色 白色兴趣：健身 网球 唱歌个性： 风趣幽默专长： 反应很快 嘿嘿歌声如何： 还不赖 自认中上 哈 眞的啦 录音师也这麼说^^近视：小时是电视儿童 所以 两眼都550 @@头发：微卷 以前超不爱超限慕直发的人但后来发现卷发其实好做造型也不赖 哈口头禅：没啥特别的口头禅ㄟ英文能力：国外研究所的能力搂拍过的MV：拍摄当届创作歌曲选拔冠军"难以抗拒" 的音乐录影带拍过的广告：一堆加拿大温哥华阳光男孩公益活动的广告大概有5支左右吧欣赏的女生类型：气质型家人对calvin进演艺圈的看法：书读了那麼多 给我跑去演艺圈贞士气死人哈所以我需要你们的大力只持 交出好成绩给爸妈看证明给他们看!!平常喜欢：跟好友聚在一起 做什麼都可以 因为我很重视友谊喜欢电影种类：好看的话 不管是动作 喜剧 文艺爱情 惊悚 我都爱最爱的电影：很多ㄟ不过我很喜欢妮可拉斯凯吉演的任何电影他的演技真是没话说喜欢的歌手： 不如说是音乐种类吧 Hip Pop and R&B喜欢的女演员：喜欢的男演员：梁朝伟 吴镇宇喜欢的日本艺人：木村 帅喜欢的漫画：男生爱看的 譬如 七龙珠 灌篮高手 神型太保喜欢看哪类型的小说：最想去的国家：加拿大 像是我第2个家毕竟我呆了7年我很想环游世界喜欢不同的文化喜欢的音乐类型：Hip Pop and R&B喜欢什麼动物： 狗超爱之前加拿大养了两只比熊不知道你们只不知道这个品种有点像马尔季斯但比马尔季斯大一点喜欢看书或上书店：以前在国外认为在书店喝咖啡看书是种享受很爱忙里偷闲的感觉嘿喜欢购物：超爱 基本上 我逛街可超像女生哈跟我逛街的男生都很受不了觉得我超会逛害怕什麼事物： 害怕的事还好但不喜欢伤心的事譬如失恋或跟朋友吵架这类的平常的穿衣style：两极化 有时很休闲 有时爱穿很正式耍帅 哈印象最深刻的事：7年前一个人独自上加拿大生活 一直一个人过了7年接过哪一件最辛苦的CAS：还好ㄟ 不过夏天拍戏 真是热热热希望能和所有的Fans共同做什麼事：多点见面会多认识你们我会好好努力记住你们的名字你们只要见到我我较不出你的名字就再提醒我一次 直到我记住为止哈基本上我记性很好的喔当艺人前从事过什麼工作：都在加拿大念书念研究所当过学校大学助教喜欢哪一类的书：初恋和初吻几岁：16岁 高一谈过几次恋爱：好私人喔 不过不多啦 真的 5次以下 可以了吧 哈讨厌什麼样的人：就是两面人搂梦想： 演艺圈闯出一番好成绩 这是我目前最大的愿望吧calvin名言： Shakespear says: To be or not to be, that"s a question.春天般温暖的笑容，玉树临风，极富书生气息，却又风趣幽默，加拿大阳光男孩选拔冠军、加拿大VICTORIA大学研究所及助教，目前就读於政大财政系研究所，气质与微笑之杀伤指数难以估计。

HITACHI 相对好些

机械设计制造及其自动化专业有车辆工程、机械电子工程、材料加工工程、机械制造及其自动化、机械设计及理论等考研方向。机械设计制造及其自动化专业有车辆工程、机械电子工程、材料加工工程、机械制造及其自动化、机械设计及理论等考研方向。机械设计制造及其自动化考研科目分为公共科目和专业科目，公共科目主要考《思想政治理论》、《数学》、《英语》、《数学》；专业科目主要考《微机原理》、《材料力学》等。机械机械设计制造及其自动化专业。机械机械设计制造及其自动化专业设计制造及其自动化专业旨在培养适应社会发展需要，具备较扎实的自然科学基础和宽厚的机械专业知识以及较强的实践能力。具有创新意识、国际视野、团队合作精神和良好的沟通能力；具有较好的人文社会科学素养、较强的社会责任感、良好的职业道德，能在机械工程领域从事机械产品研发、设计、制造、项目管理等工作的复合型工程技术人才。机械设计制造及其自动化专业核心知识领域包括：机械设计原理与方法、机械制造工程原理与技术、机械系统中的传动与控制、计算机应用技术等。机械设计制造及其自动化专业毕业生就业主要在机械、汽车、航空航天、能源、化工、电子、材料、冶金等行业领域，从事机械领域内的设计制造、科技开发、应用研究、运行管理和经营销售等方面的工作。

罗茨鼓风机叶轮和气室制造特点间隙小，尺寸精密，利用叶轮快速旋转，把空气从出风口排出，从入风口吸入。 福建春鼎

偶然的机会参加了学校的“千人留学计划”，通过面试后顺利进行为期半年的交换生生涯。我选择的大学是台湾元智大学，因为学中文的缘故，并没有选择到欧洲国家，想到台湾感受更多的中华文化和不同之处。 我当时是因为人数没有凑够而补交的申请，如果没有第二次留意的话就错失了这次机会。其实在校园中有各种各样的活动和交换计划，比如有出国见习，出国交换，出国交流，以及到985 211等院校交换，活动方面还有很多省级和国家级的比赛，比如“挑战杯”，大学生创业竞赛......等等。 同学们要多加留意校园里的留学计划和活动。比赛不仅能够加学分，还能丰富你的经历，从中得到的锻炼。 那么当一次交换生也可以丰富你人生的阅历，俗话说“读万卷书不如行万里路”，书本上的知识让我们了解世界，而行走在路上让我们看见世界，拥抱世界，获得无法附加的人生和宝贵的记忆财富。 无论到了哪一个新的环境，总有矛盾的心理状态，我们称之为——忐忑不安。忐忑的是自己终于到了一个新的环境，比过去的自己厉害了那么一点，却不知道自己在这个全新陌生的环境里将会面临什么；不安是源自对未知的恐惧，就像明天和意外你不知道哪个先来。 也正是因为这样的缘故，所以劝大家多出门看看。及时行乐大抵不该被认为是灯红酒绿，莺歌燕舞，纸醉金迷或放纵自我，而是把握时机做自己想做的事，追自己想追的梦，看见更清晰更真实的世界，在行走中记忆，在行走中感受，在行走中体会生活。 不要因为家里的束缚就变成按部就班的书呆子，不要因为父母的担心就不远游，俗话的正解是“父母在，不远游，远游必有方”。 过去的交通不便利，人也固守家乡，外婆担心我一个女孩子在外人生地不熟，说别瞎折腾。可外公要是还活着，大抵会支持我各地游历，他总想让我闯荡一点。 人只活这么一次，如果不多了解一点，不多记住一点，不多积累一点，等哪天回头看的时候，大概会遗憾才走了那么短短的几步。 前段时间网上传一个段子：一个老板打电话说大学生有什么用，还不是给我打工，前面买票的大学生听见了便把自助端改成了英文版。 虽然成为谈资大家一笑而过，可文化这个东西的确是潜移默化的，所谓“腹有诗书气自华”。 三毛也说过：读书多了，容颜自然改变，许多时候，可能自己看过的书籍都成过眼烟云，不复记忆，其实它们仍然潜在气质里、在谈吐上、在胸襟的无涯，在精神的深远。当然也可能显露在生活和文字中。 游学大概也是这样的效用。在游学的过程中我们不是一个只会购物和发朋友圈炫耀的“贵妇”，我们在校园感受学生的不同，感受教学方式的不同。感受不同文化环境下的人群和气氛。 在熙熙攘攘的街道感受拿着咖啡赶路的白领，抱着孩子的母亲和穿着校服成群结伴回家的学生。我们关注等红绿灯和闯红绿灯的情况，我们关注商店服务员的态度，我们关注周围人的眼光，我们关注街道上没有垃圾桶也没有垃圾...... 我在一家咖喱饭餐厅吃饭，出门时看见刚才为我们服务的服务员蹲坐在墙角，穿着黑色衬衣和酒红色围裙的工作服，抽着烟。她一头干净利落的短发，长得格外清秀帅气，让我不住多瞥了几眼。台北的夜景在她身后像巨大幕布，她在餐厅二楼忙里偷闲享受一刻钟的惬意。 这让我突然联想到每个人在这一分钟都在做些什么？一百个人有一百种人生，你在世界的哪个角落，你在做着什么，又有谁正过着你想要的生活？ 而此时此刻的我在台湾看夜景和夜景下的你，写下了这段话，不像普通的游客谈论着餐食多美味，接下来去哪里购物。 这是我游学经历里可以称为美妙的事了，看见世界，拥抱世界。

QQIP地址查询．有时候出出错的．．比如IP被分到了别的地方．而数据库没有更新．．那就显示错了．还有IP不一定准的．．人家使用代理上网的话．就可以显示别的地方的IP．．比如说我用上海别人的免费代理服务器上网．那我的IP也就会显示成上海的了实际我在山东

机械工程和机械设计制造及其自动化区别：一、概念不同：1、机械设计制造及其自动化：是研究各种工业机械装备及机电产品从设计、制造、运行控制到生产过程的企业管理的综合技术学科。2、机械工程及自动化：以有关的自然科学和技术科学为理论基础，结合生产实践中的技术经验，研究和解决在开发、设计、制造、安装、运用和修理各种机械中的全部理论和实际问题的应用学科。二、课程设置不同：1、机械设计制造及其自动化：机械制造工艺学、机械系统设计、机电控制系统分析与设计、机械制造装备设计、数控技术及应用。高等数学、线性代数、概率论与数理统计、大学物理、大学物理实验、普通化学及实验、工程图学、理论力学、材料力学、电路基础。机械原理、机械零件、电子技术、互换性与技术测量、工程材料、金属工艺学、测试与传感技术、制造技术基础、液压与气动技术、机电传动控制、机械工程综合实验、微机原理与结构技术、CAD/CAM、单片机原理及应用。2、机械工程及自动化：工程力学、机械设计基础、电工与电子技术、微型计算机原理及应用、机械工程材料、制造技术基础。现代企业管理；测控技术；机械工程实验（II）；机械控制工程理论基础；精密加工技术；流体传动与控制；生产实习；装备与制造技术基础；数控技术；机械工程计算方法；材料成形技术基础；现代加工。三、学科等级：机械制造及其自动化（080201）是二级学科名；一级学科名：机械工程（080200）。扩展资料：机械设计制造及其自动化毕业生应获得的知识和能力：1、具有较扎实的自然科学基础、较好的人文、艺术和社会科学基础及正确运用本国语言、文字的表达能力。2、较系统地掌握本专业领域宽广的技术理论基础知识，主要包括力学、机械学、电工与电子技术、机械工程材料、机械设计工程学、机械制造基础、自动化基础、市场经济及企业管理等基础知识。3、具有本专业必需的制图、计算、实验、测试、文献检索和基本工艺操作等基本技能。4、具有本专业领域内某个专业方向内所必要的专业知识，了解其科学前沿发展趋势。5、具有初步的科学研究、科技开发及组织管理能力。6、具有较强的自学能力和创新意识。参考资料来源：百度百科--机械工程参考资料来源：百度百科--机械设计制造及其自动化

yiru

我这边是大连的，NTT 大连，做手机软件的.加班费不多（几乎没有）待遇方面，看你是做啥职位。一般三年经验的话，测试能拿个5，6K吧，开发职位会高一些。如果是社招，一般随项目走，有项目时会招人。不会像校招那么固定 学到的基本上是工作流程，一般没有太多核心技术，但是这就足够了，因为在国内的外企都没有什么技术，如果你稍微有点基础，在一家混熟练了基本上到哪都可以胜任

midnight是品牌。midnight是一款珠宝首饰的品牌。midnight是海瑞温斯顿的midnight静夜系列珠宝。所以midnight是品牌。