EMSA实验步骤

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

EMSA全称是Electrophoretic Mobility Shift Assay，中文叫凝胶迁移实验或电泳迁移率实验，它是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术，可用于定性和定量分析。这项技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理。首先让蛋白质与末端标记的核酸探针结合，然后在跑PAGE胶，结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢，这样，从PAGE胶的电泳结果就可以判断，该蛋白是否和特定序列结合或者该序列是否和蛋白结合。

没做过

凝胶阻滞或电泳迁移率变动实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA） （来自《养鲤鱼》微信公众号） 1、为什么看不到迁移带？ 1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。 2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。 3）探针与蛋白无特异性的相互作用。 4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。 5）曝光或者成像时间过短。 在Super-Shift EMSA测定中看不到Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因： 6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。 7）测定的活化的DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到Super-Shift的带，也看不到DNA/蛋白复合物的量的减少。 8）使用的抗体过度稀释。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。 9）多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到Super-Shift的带，但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。 2、为什么实验背景高？ 1）曝光或者成像时间过长。 2）封闭时间不足或者效率不高。 3）洗涤效果不佳 4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。 3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针？ 对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白:DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍；用粗制核抽提液，需要2-10ug蛋白形成特异的复合物。 部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80℃、探针应保存在-20℃以防止降解。 无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。 4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用？ Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在EMSA反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在0.05mg/ml左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。 为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的DNA，其序列与标记探针相同，故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。非特异竞争探针的长度组成和DNA探针相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是标记的探针用量的30-100倍（w/w）。 5、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？ 将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将TGE缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。在4℃进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。 当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。

转录因子和蛋白质结合的情况可以通过多种实验来验证。以下是常用的几种实验方法：1. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)：通过电泳迁移实验可以观察到转录因子与DNA结合后，复合物的迁移速度会变慢。而加入竞争性DNA片段或者抗体等会破坏该结合，从而使复合物不稳定，以致迁移速度回到原来的状态。2. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay：通过在细胞内部免疫沉淀转录因子及其结合到DNA上的小段染色质并清洗后，进一步检测其结合到靶基因上（序列分析）或者使用引物鉴定附着区域是否被转录因子组件包含。3. Yeast two-hybrid assay：此实验利用了酵母细胞中两个不同功能区蛋白（例如AD和BD）构建相互作用模型。将编码转录因子和其鉴定出的结合蛋白浸入到不同功能区的酵母中进行配对，如果有关联，则证明它们可以在活细胞中相互作用。这些实验都可以可靠地验证蛋白质与转录因子之间的结合关系。在实验室操作过程中，需要根据具体情况选择合适的实验方法，同时保证实验条件的严谨性和准确性。

在EMSA实验中，根据目的不同，所需使用的蛋白质量也会有所变化。通常情况下，蛋白的使用量为1-10微克之间。但是需要具体根据实验需要进行调整。EMSA凝胶迁移实验用于研究蛋白与核酸结合的实验技术。该实验以聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础，利用电泳的原理来检测蛋白与DNA或RNA分子的配对情况。emsa实验蛋白用量1、蛋白用量的确定EMSA实验中，蛋白的使用量应该通过实验计算、考虑样品量和标准曲线绘制等操作来确定2、样品准备首先从生物样品中提取目标蛋白，并用SDS-PAGE对蛋白进行定量和纯化。通常情况下，可以将纯化后的蛋白样品以50-100微克/微升的浓度储存，并适当稀释用于实验分析。3、滴定法测定蛋白浓度滴定法常用于测定蛋白质的浓度，在EMSA实验的蛋白用量计算中也有重要作用。首先，需要准备一定浓度的荧光素化合物（如BCA），然后将标准蛋白和待定蛋白分别用不同的浓度稀释，添加适量的荧光素试剂，并根据颜色变化来测定样品蛋白质的浓度。4、选择适当的蛋白量经过滴定法测定蛋白质浓度之后，可以选择适当的蛋白量进行实验。在实验中，蛋白质的使用量通常在1-10微克之间。如果使用的蛋白过多，可能会影响实验结果，使得最终的检测信号过强，掩盖低浓度样品的信号。而使用的蛋白过少，则很难观察到目标蛋白和DNA或RNA结合的迁移带。5、实验过程中的注意事项在EMSA实验过程中，还需要注意一些重要的步骤和原则，以确保实验结果的可靠性和准确性。如样品预处理、电泳缓冲液的选择和pH值的调节等。此外，为了避免扰动实验结果，还需要注意实验条件的控制，如温度、湿度、时间和光照等因素。EMSA凝胶迁移实验中，蛋白的使用量通常在1-10微克之间，但需要具体考虑实验需求、样品量等情况进行调整。在实验过程中，还需要注意一些重要的步骤和原则，以确保实验结果的可靠性和准确性。

EMSA 凝胶迁移实验检测的蛋白与其靶分子（通常是DNA或RNA）结合后形成的复合物在凝胶上出现了迁移减缓或者移动位置发生改变。一、蛋白在胶孔中滞留，可能是由于以下几个主要原因：1、胶溶液中存在高浓度的离子：高浓度的离子可以干扰蛋白与DNA或RNA的相互作用，从而影响迁移结果。2、蛋白与DNA或RNA的比例不恰当：如果加入的蛋白太多，会出现蛋白与DNA或RNA的比例失衡，导致蛋白在胶孔中滞留。3、组装复合物时间过长：如果组装复合物的时间过长，会导致复合物形成过程不完全或者不稳定，这也会导致蛋白在胶孔中滞留。4、蛋白稳定性不佳：如果蛋白质无法在凝胶电泳过程中保持稳定性，也会导致其在胶孔中滞留。蛋白质胶孔滞留问题的解决方法是：1、减少离子浓度2、调整蛋白与DNA或RNA的比例3、适当缩短组装复合物的时间，并检查蛋白的稳定性。4、在加载样品时，应尽量避免将蛋白团块直接加入凝胶孔中，而应该将其预先均匀混合。如果以上方法仍然不能解决问题，可能需要重新优化实验条件。

每个对照组的目的：1. 看光有探针，没有其他成分时，探针的位置，应该位于最下方。不然说明探针里面有杂质，影响电泳2. 这个是看蛋白和探针的结合，是实验目的3. 看探针结合的特异性。如果冷探针可以竞争结合，阻碍了标记的探针，说明2中的结合是特异的4. 目的和3相同。突变的冷探针应该对2的结果没有影响5. 也是判断特异性，这次是看蛋白的特异性，和抗体结合后，就会有super-shift。如果没有，说明是其他的蛋白结合。

1.EMSA中一般都是用P标记的探针，具有放射性，要是用生物素标记的话，放射性就小了，但是花的钱就多了。这个实验要是样本不多的话，大约花费4000左右吧，最重要的是放射性的问题，必须有磷屏，否则没法做。2.首先说应该用磷酸化的P65抗体，一般都用santa cruz公司的。并且有分装的，420块钱100μl，你要是做得少的话可以选择分装的抗体。3.还有就是免疫组化也是可以的。还有一种更好的方法就是promega的双荧光素酶报告系统，采用海肾和萤火虫两种荧光素酶，一种报告目的基因，一种报告内参，很好的方法，但是很贵。总体来说，做EMSA和双荧光素酶是最好的方法，算是定量，但是EMSA有放射性，双荧光素酶比较贵。western和免疫组化只能用来半定量，但是做的人比较多，也能发高水平的杂志，相对来说比较简单，也省钱。

生物标记emsa中可能出现探针生物素丢失　　EMSA结合反应：(1) 如下设置EMSA结合反应阴性对照反应：Nuclease-Free Water 7微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升标记好的探针 1微升总体积 10微升样品反应：Nuclease-Free Water 5微升EMSA/Gel-Shift结合...　　BAS-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

EMSA结合反应：(1) 如下设置EMSA结合反应阴性对照反应：Nuclease-Free Water 7微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升标记好的探针 1微升总体积 10微升样品反应：Nuclease-Free Water 5微升EMSA/Gel-Shift结合

1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如:NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等; 2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等; 3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原; 4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失; -1mM的PMSF，防止目的5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1 蛋白被降解; 6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%(v/v) 7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质; 8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间; 9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍(最高可6M)，尿素(最高可8M) 10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染组氨酸标签蛋白的纯化

那这几种技术要同时用吗？ChiP与EMSA的区别是什么呢？

多个核型多角体病毒 标记救援 反密码子摆动假说 棉铃虫核型多角体 代谢质粒 病毒附着蛋白 广泛宿主范围载体 实时PCR EMSA

不会是loading buffer 出问题沉淀堵孔了吧一般不会的哦。。。。我没有做过，，猜测猜测……

欧洲主流的保温壶都是用玻璃内胆的，玻璃内胆和市场中低端的玻璃内胆有以下区别 1、玻璃不能含重金属。 2、玻璃镀层须为纯银，加工不能使用石棉等危险物质。 3、 玻璃胆为人工制造，成本和耐用性大大提高。 4、人工制造的玻璃胆在内壁表层有许多不规则纹路和毛细微孔，饮品入内可以形成如紫砂壶相似原理的缓释氧化和保温的作用，因此人们喜欢直接用玻璃保温壶盛放咖啡和茶类饮品，而不是单纯的热水。 5、容量基本为1升至1.5升，设计原理是考虑到正常人3-5小时的饮料容量。避免‘老水"。 6、人工内胆对水中的重金属等杂质的吸附能力比不锈钢和机器玻璃胆有更好的表现，而且由于玻璃结晶自然形成，毛细孔弧度天然，更加容易清洗。 7、玻璃内胆无法和不锈钢内胆的强度相提并论，一般用于办公和居家使用。不锈钢内胆适合高强度和户外场合使用。 8、不锈钢内胆必须使用优质不锈钢，否则可能存在重金属或锈蚀的风险。

首先，你需要确定你的目的蛋白正确融合上了GST标签，建议先用anti-GST抗体对lysis上清做个western。当然如果你和你同学用的是同一个质粒的话，那么这一步就不必了。若标签没有问题，你在Flow Though里又可以在目标分子量大小处检到蛋白的话，那么出现这种情况只可能是glutathione、柱子以及buffer的问题。关注你所使用的GSH的保存条件、状态以确保没有被氧化；换一批Glutathione Sepharose 填料或用你同学用过的柱子试试；视情况对binding 的PH、盐浓度、DTT浓度做个优化 ，调整washing 及elution buffer glutathione 浓度。必要时甚至可以考虑更换缓冲体系。没有见到你的protocol所以不好更具体的说，但是需要强调的一点是，不要完全依赖protocol。不同的蛋白个性差异很大，同一个protocol做相同类型的不同的蛋白可能会得到完全不同的结果，因此很多时候对各个影响因素做若干水平的正交实验来确定一个符合实际需要的条件 是往往是必须的。

poly(dI:dC)（dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？ 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)（dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)（dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)（dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)（dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用...poly(dI:dC)（dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？ 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)（dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)（dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)（dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)（dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝胶迁移反应，它们会带有目的蛋白的结合位点。

一.Enjoyhot&cold冷暖相宜容器产品特有技术：EMSA高规格的多层晶钻隔热瓶胆 2层优质耐热玻璃/EDS-layers技术,全人工内胆制造。内胆内壁充分的极微小气穴，形成犹如紫砂原理的缓释效果，完美保持饮品原味2层纯银镀层，产生有效的热反射，安全无污染风险1层高真空，高效隔热一体成型 二．Enjoymobilelife怡享旅程器皿系列特有技术:专利的u201ePowerLoc“-Closure:单手按压式杯盖全拆卸清洁设计100%防漏高真空保温高标准选材工艺，全面符合欧盟儿童食品接触标准三．Freshnessguaranteed&organized易鲜生活储藏收纳系列特有技术：1．欧盟婴童食品接触安全材料工艺通过欧盟DINEN14350-2EU的严格要求，成为市场目前唯一通过此要求的食品保鲜容器。2.无缝一体成型密封系统l优势1:高密封压力，真正实现100%防漏。n大多数食物保存时间更长*.nEMSA独有的一体成型密封圈比普通双孔硅胶圈密封压力更大n蓝色胶圈与透明盒盖一体成型，不会剥落。l优势2:无缝，无细菌滋生空间n密封圈与盒体一体成型n加宽的密封设计，安全，方便清洗 n无缝，无细菌滋生的死角,100%无异味渗出l优势3:实用的细节设计，通过专业餐饮行业使用HACCP认证四．‘Prepare&servefreshness"易鲜生活餐厨工具特有技术l‘Turbo"加速，转速提高40%以上l‘Spacesaving"设计，节省空间70%l优良的选材和加工工艺，全面符合欧盟儿童食品安全标准l‘Allin1"整合设计，提供全面的餐厨解决方案五．‘Plants/flowerspresented&cared"多彩四季园艺养护特有技术l‘AQUA-COMFORT"自动供水技术l‘360spray"超细喷雾工艺l完整的色系搭配设计六．Esteras爱斯特拉户外园艺特有技术l‘AQUA-COMFORT"自动供水技术l超轻光纤喷涂技术lFreecare便捷养护设计lUVfree10年抗紫外工艺

简单点说pkcs1中的填充就是【00 01+若干ff+00+明文数据】总长度为模长，例如rsa1024为128字节。还是实际搞个rsa1024例子吧 00 01 FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF FF 00 30 21 30 09 06 05 2B 0E 03 02 1A 05 00 04 14 EC A2 4D 06 CE 34 6A A8 4E E5 61 E2 D4 4A D9 9F A4 0A 47 34最后的为实际数据30 21 30 09 06 05 2B 0E 03 02 1A 05 00 04 14 EC A2 4D 06 CE 34 6A A8 4E E5 61 E2 D4 4A D9 9F A4 0A 47 34

一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。扩展资料由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学 软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。同时，由于EMSA在体外不能模 拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。参考资料来源：百度百科-EMSA （凝胶迁移）

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

凝胶迁移实验1)什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验？凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。2)作这样的实验需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。Promega公司的Riboprobe?/sup系统（a,b）（目录号P1420，P1430，P1440，P1450，P1460）可用于同位素标记的RNA的体外合成，DNA5`末端标记系统（目录号U2010）用于制备DNA探针，结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)?dI:dC)，也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage?/sup分析。3)凝胶迁移实验系统提供了什么试剂？Promega公司提供一种凝胶迁移实验系统检测DNA结合蛋白，系统可作为这类实验的 一种正对照。系统包括目的寡核苷酸，对照DNA结合蛋白，结合缓冲液，用于寡核苷酸探针末端标记所需的试剂。Core 系统（目录号E3050）包括含重组AP2蛋白（AP2抽提液）的大肠杆菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是从表达AP2蛋白的大肠杆菌中提取的。另外，Core系统还含SP1同源寡核苷酸，凝胶迁移结合缓冲液（5′），和能作20次对照实验的HeLa核抽提液。Complete系统（目录号E3300）含另外5个双链寡核苷酸，分别是AP1、OCT1、CREB,、NF-kB、 TFIID结合位点的同源序列。这些寡核苷酸可以在末端标记后用作特异性探针，或在竞争实验中用作非特异性探针。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。4)成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（20ul）。为满足一般要求，结合缓冲液含4%甘油，1mMMgCl2, 0.5mMEDTA, 0.5mMDTT, 50mMNaCl, 10mMTris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9), 50mMKCl, 1mMDTT, 1mMEDTA, 10%甘油，0.05mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。参考凝胶迁移实验技术手册TB110获取更多的资料。5)提供了哪些同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？有各类dsDNA探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和这些引物序列的出处。转录调控因子探针---------------------------------------探针名 目录号 序列（上链） 序列的出处Sp1 E3231,E3232 5`-ATT CGA TCG GGG CGG GGC GCG-3` SV40启动子（1）AP1 E3201 E3202 5`-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3` 胶原酶基因TRE（2）AP2 E3211 E3212 5`-GAT CGA ACT GAC CGC CCG CGG CCC GT-3`人金属硫堇II a(3)基因NF-kB E3291, E3292, 5`-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3`鼠Igk轻链基因（4）Oct1 E3241 E3242 5`-TGT CGA ATG CAA ATC ACT AGA A-3` Ig重链基因（5）CREB E3281 E3282 5`-AGA GAT TGC CTG ACG TCA GAC AGC TAG-3`大鼠生长激素抑制基因（6）TFIID E3221 E3222 5`-GCA GAG CAT ATA AGG TGA GGT AGG A-3`belta-1球蛋白启动子只列出了上链的序列，探针是双链，下链序列和上链序列配对。黑体字表明序列来源于指定的基因序列，转录调控因子结合的序列用下线表明。一般而言，周围的核苷酸是任意。6)在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要因素？目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp）,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。7)用以下一些转录调节因子和HeLa细胞核抽提物可形成哪些复合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白的来源时，每1个转录调节因子和它相关的DNA同源序列结合形成特征型的结合形态。以下的文字描述了每一个单独的转录调节因子，包括识别的同源序列，因子的大小，特定的结合条件，以及和HeLa细胞核抽提物可形成的复合物的数目。1．AP1：AP1（激活蛋白1）是一个转录调节因子，它结合的同源序列为5`-TGAGTCA-3`。当基因的启动子区域存在AP1的结合位点时，这些基因可以被诱导，比如用佛波酯可诱导蛋白激酶C（2，7）。在细胞中，AP1形成c-Jun或Jun相关蛋白的同聚双体，或者形成c-Jun或Jun相关蛋白和c-Fos或Fos相关抗原（Fras）的异源双体。Fos蛋白自身不能形成同聚双体，并不能单独和AP1结合位点结合。c-Jun蛋白是一个40kDa的单体蛋白并通过亮氨酸拉链形成同聚双体。在HeLa细胞中，AP1的主要形式是c-Jun蛋白的同聚双体。在凝胶迁移实验中，形成一个特异的复合物。当作凝胶迁移实验测定AP1的活力时，除了基本的溶液组分外，应将0.01mg/ml poly(dI:dC)?dI:dC),100ug BSA, 5mMDTT加入到结合缓冲液中。如用纯化的蛋白，则用1-2ug的蛋白来检测迁移复合物。2．AP2：AP2是一个转录调节因子，可分别作为TPA-和cAMP诱导因子（10）。它是一个52 kDa的蛋白，识别的同源序列为5`-CCCCAGGC-3`或5`-GCCNNGGC-3`（3）。这个因子对视黄酸特别敏感，可能在形态发生中起着重要作用。HeLa细胞核抽提物和AP2同源DNA探针形成一个特定的复合物。用纯化的蛋白作凝胶迁移实验时，应用20-50ng的蛋白。3．CREB：CREB是一个37 kDa的转录调节因子，对cAMP应答，识别5`-T（G/T）ACGTCA-3`DNA同源序列（6，11）。它含亮氨酸拉链结构而形成同聚双体，相关的基本结构域和c-JunDNA结合结构域同源。当用HeLa细胞核抽提物时，能和CREB同源序列形成一个复合物。4．NF-kB：NF-kB最初被鉴定为在B细胞中和免疫球蛋白k轻链的增强子结合。但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，形成NF-kB和IkB的复合物。最初在DNA结合蛋白复合物中分离的NF-kB是由p65(RelA)和p50构成的异源双聚体。其他分离的单体包括p49（也可称为p52），p75（c-Rel）,p68(RelB)。p65，p68，p75单体起反式激活作用。p50，p49（p52）单体具有DNA结合活力，但只具有微量的反式激活作用。据报道p49和NF-kB的单体p65形成具有转录活力的异源双体，类似于p50/ p65异源双体。p49/ p65和p50/ p65异源双体在细胞质中受一种叫IkBa/MAD-3的抑制剂调节。IkB和p65单体结合，阻制了细胞核中的定位和DNA的结合。在体外高浓度的p65能形成同源双聚体，能和DNA微弱地结合。Poly(dI:dC)能抑制这一反应（14）。p49和p50也能形成同源双聚体，但在细胞中的浓度很低。通常，在作NF-kB的凝胶迁移实验时，在20ul的反应体积中，有溶于10 mM HEPES的0.28pmoles 的NF-kB9寡核苷酸（pH7.9), 50mMKCl, 0.2mMEDTA, 2.5mM DTT, 10%甘油, 0.05%NP-40。当用纯化的蛋白时，250-300ng足以形成凝胶迁移复合物，而需用10ug的HeLa细胞核抽提物。凝胶迁移复合物在室温中保温30分钟，在50mMTris(pH8.3)和38mM甘氨酸的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离凝胶迁移复合物。含考马斯兰和二甲苯蓝色素的加样溶液只能加入到阴性对照反应中，因这两种色素会加剧NF-kB复合物的解离。当用HeLa细胞核抽提物作为结合蛋白来源时，可形成两种序列特异的凝胶迁移复合物，即p50/p50同源双聚体和p50/ p65异源双聚体。在表达p49，p50，p65的细胞中，可检测到4个序列特异的凝胶迁移复合物（p49/ p49，p50/ p50，p50/ p65，p49/ p65），如果存在高浓度的p65，可检测到微量的p65/p65。下列试剂可加强NF-kB在体外的结合：mM的GTP，ATP，精胺，亚精胺，钡或钙离子，ng的Co+3(NH3)6（12）。5．OCT1：OCT1是OCT转录调节因子家簇中的一员，显然在哺乳细胞中存在比较广泛（5）。POU结构域包括POU-box和Homeo结构域。当用HeLa细胞核抽提物时，可检测到一个与OCT1同源探针形成的序列同源凝胶迁移复合物。6．SP1：SP1是一个O-糖基化的转录调节因子，它识别10个核苷酸长度的同源序列5`-GGGGCGGGGC-3`（1）。核心识别序列是5`-GGGGCGGG-3`。同核心序列相似的序列常存在于启动子中。SV40的早期启动子就是一个例子，它是第一个可以结合SP1的启动子。根据糖基化的不同，它的分子量在95-105kDa，DNA结合结构域中的三个锌指纹决定了序列的特异性。HeLa细胞核抽提物与SP1同源探针形成特异的凝胶迁移复合物。7．TFIID/TFIIB：TFIID和TFIIB是基本的转录调节因子，参与RNA聚合酶II启动子的基本的转录（16）。TFIID与真核启动子的TATA区域形成特异的DNA结合。TFIID由几个蛋白组成，而其中的TATA区域结合蛋白（TBP），参与TATA序列的结合。TFIID的其他的蛋白组分被称为TBP-相关因子（TAFs）。用TFIID探针寡核苷酸和HeLa细胞核抽提物，可得到一个微弱的凝胶迁移带，但很难确定为是TFIID序列特异凝胶迁移复合物。纯化的重组的TBP很难作凝胶迁移实验，这部分是由于TBP存在很强的正电荷，导致TBP/DNA复合物很难进入凝胶。纯化的TBP形成二聚体后不能结合DNA（17）。因此形成的二聚体可参与DNA结合。TFIIB不单独与DNA结合，但与TFIID结合后增强它与DNA的结合。TFIIB与预启动复合物结合后，致使RNA聚合酶II和TFIIF结合到转录启始区。故TFIIB在预启动复合物的形成中有重要作用。当用纯化的TFIID作凝胶迁移实验时，poly(dI-dC)不用加入结合反应中。结合缓冲液含10%甘油，20mMTris(pH8.0), 10mMMgCl2, 2mMDTT, 89mMKCl。对TFIID的凝胶结合实验中，可加入poly（dG:dC）?dG:dC。形成的复合物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，凝胶组分是：0.5′TBE, 6%聚丙烯酰胺凝胶(19:1丙烯酰胺:双叉),4mMMgCl2, 0.02%NP-40, 电泳缓冲液组分是：0.5′TBE，4mMMgCl2, 0.02%NP-40。当研究含TFIID和TFIIB的复合物时，应从结合缓冲液，凝胶，和电泳缓冲液中去除MgCl2。这些是一般的要求，用不同的细胞抽提物和TFIID、TFIIB形成复合物作凝胶迁移实验时，应对多种因素进行优化以达到理想的条件。8)在一次凝胶迁移实验中，用多少量的蛋白质或抽提物，和标记的DNA探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化，一般所用纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白：DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白形成特异的复合物。所加入反应的探针的量是50，000-200，000cpm32P-标记的探针（高特异活性），反应体积为1-5ul。这相当于10-50fmoles的DNA探针。探针应保存在-20oC以防止降解，在合成或标记后1-2个星期内必需使用。无论探针或是结合蛋白应避免多次冻融。9)能用体外翻译法制备目的蛋白质吗？Promega没对所有的转录调节因子作这类测试。一般，用麦胚抽提物作哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白的体外翻译，兔网织红细胞溶裂解液可能含有内源哺乳细胞转录因子或DNA结合蛋白。但TNT？/sup>兔网织细胞溶解液系统（a,b,c,d）与TranscendTM 生物素标记的tRNA(目录号E3201)一同使用，翻译了转录调节因子AP1（c-Jun），它使AP1同源寡核苷酸（目录号E3201）产生的迁移效果和重组的AP1相同（18）。TNT？/sup>T7偶联的麦胚抽提物（b,c,d,e）在体外翻译了c-Rel。这一蛋白特异地使免疫球蛋白k轻链增强子探针产生迁移。在c-Rel结合反应中加入体外翻译的MAD-3（IkB家簇中一员）可干扰其相互作用。10)poly(dI:dC)?dI:dC)，非特异性竞争DNA，特异性竞争DNA的功能是什么？它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)?dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)?dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)?dI:dC)。为确定所形成的复合物的特异性，在含或不含增量的非放射性的特异竞争DNA或非特异的竞争DNA时，作结合反应的竞争实验。一般，非放射性的特异DNA是非标记的DNA探针，非特异的竞争DNA ，长度组成和DNA探针相同，序列不同。用非放射性的特异DNA能竞争掉，而用非特异的竞争DNA不能竞争掉的复合物，表明目的蛋白和同位素标记探针的特异结合。非特异结合能用特异DNA和非特异的竞争DNA竞争掉。结合溶液中的poly(dI:dC)?dI:dC)的量需作优化，但一般用0.05mg/ml。非放射性的（特异或非特异）的竞争DNA的用量也需优化或滴定，但竞争DNA通常是同位素标记的探针的10-1000倍（w/w）。其他类型的竞争DNA如小牛胸腺DNA不能用于凝胶迁移反应，它们会带有目的蛋白的结合位点。11)用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为6%（30：1丙烯酰胺：双叉），在特定条件下可用高或低的浓度。PH, 聚丙烯酰胺的浓度, 丙烯酰胺：双叉丙烯酰胺的比会影响复合物在凝胶中的迁移。大多数蛋白用10-15伏的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压（30-35伏的电压），电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的，无沉淀。低的离子强度和丙烯酰胺基质的`箱子效果`有助于复合物的稳定。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。凝胶必需完全聚合，以避免带型拖尾。如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。在含抽提液的带中不含游离探针或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。目前可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物（Metaphor?/sup/agarose）。12)如何在一个特定的复合物中确定一个蛋白质的存在？部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。确定复合物中蛋白的特征可能会困难，但有一些方法作这方面的研究。如有目的蛋白的抗体，可进行超迁移实验，抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。增量的抗体加入到结合反应中。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体结合后，再加入探针。取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度的减少。在大多数实验中，应对抗体作滴定，先使抗体：蛋白的摩尔比为1：1，然后应需要增加抗体的量。当有纯化的蛋白时，可用它们和实验的带型迁移复合物比较。除超迁移实验外，复合物中蛋白的特征也可用UV交联和标记转移来分析。在均质标记的探针和细胞核抽提物保温后，用UV照射使复合物交联，随后用DNA酶降解未保护的探针。需用均质标记的探针，因DNA酶会从末端标记的探针中除去标记。和保护的几个核苷酸交联的蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离，干燥，放射自显影。结合蛋白的分子量可和标准分子参照物比较。也可用目的蛋白的抗体对复合物作Western印迹分析（20）。如一个蛋白和DNA探针的特定序列结合，可用含保守结合序列的竞争寡核苷酸，以及突变体来确定它的特征。也可用定点突变将保守序列结合位点改变来研究复合物的形成。参考资料1. Briggs M R et al 1986 Science 234, 472. Lee W et al 1986 Cell 49, 7413. Williams T et al 1989 Genes Dev 2, 15574. Sen R and Baltimore D 1986 Cell 46, 7055. Parlsow T G et al 1984 Proc Natl Acad Sci USA 81, 26506. Montminy M R et al 1986 Proc Natl Acad Sci USA 83, 66827. Angel P et al 1987 Cell 49, 7298. Chiu R et al 1988 Cell 54, 5419. Rauscher F J et al 1988 Cell 52,47110. Imagawa M et al 1987 Cell 51, 25111. Berkowitz L A and Gilman M Z 1990 Proc Natl Acad Sci USA 87, 525812. Baeuerle P A 1991 Biochim Biophys Acta 1071, 6313. Duckett C S et al 1993 Mol Cell Biol 13, 131514. Urban M B et al 1991 EMBO J 10(7), 181715. Dynan W S and Tjian R 1983 Cell 35, 7916. Peterson M G et al 1990 Science 248, 165217. Coleman R A et al 1995 J Biol Chem 270, 1384218. Beckler G and Hurst

单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA,但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到.

1. 避免缓冲液高浓度电供体基团比:NH4甘氨酸精氨酸Tris等等;2. 各种缓冲液能强螯合剂EDTAEGTA等等;3. 各种缓冲液能高浓度强原剂比DTT防止二价Ni原; 4. 能含离型垢剂比SDS防止Ni流失;-1mMPMSF防止目5. 破碎细胞候建议加入蛋白酶抑制剂比0.1蛋白降解;6. 缓冲液加入甘油防止蛋白间由于疏水相互作用发聚集沉淀甘油浓度高达50%(v/v)7. 应避免含碳酸氢钠柠檬酸等物质;8. 缓冲液NaCl浓度应300mM2M间;9. 加入变性剂促溶盐酸胍(高6M)尿素(高8M) 10.加入非离型垢剂TritonTweenNP40等高2%减少背景蛋白污染除核酸污染组氨酸标签蛋白纯化没有意义建议自己下去查查资料

1. 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如:NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等;2. 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA，等等;3. 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如DTT，防止二价Ni被还原; 4. 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失;-1mM的PMSF，防止目的5. 在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如0.1蛋白被降解;6. 缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达50%(v/v)7. 应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质;8. 缓冲液里NaCl的浓度应在300mM到2M之间;9. 可加入变性剂促溶，盐酸胍(最高可6M)，尿素(最高可8M) 10.可加入非离子型去垢剂，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染组氨酸标签蛋白的纯化感觉这样的提问没有意义建议自己下去查查资料

机械工程和机械设计制造及其自动化区别：一、概念不同：1、机械设计制造及其自动化：是研究各种工业机械装备及机电产品从设计、制造、运行控制到生产过程的企业管理的综合技术学科。2、机械工程及自动化：以有关的自然科学和技术科学为理论基础，结合生产实践中的技术经验，研究和解决在开发、设计、制造、安装、运用和修理各种机械中的全部理论和实际问题的应用学科。二、课程设置不同：1、机械设计制造及其自动化：机械制造工艺学、机械系统设计、机电控制系统分析与设计、机械制造装备设计、数控技术及应用。高等数学、线性代数、概率论与数理统计、大学物理、大学物理实验、普通化学及实验、工程图学、理论力学、材料力学、电路基础。机械原理、机械零件、电子技术、互换性与技术测量、工程材料、金属工艺学、测试与传感技术、制造技术基础、液压与气动技术、机电传动控制、机械工程综合实验、微机原理与结构技术、CAD/CAM、单片机原理及应用。2、机械工程及自动化：工程力学、机械设计基础、电工与电子技术、微型计算机原理及应用、机械工程材料、制造技术基础。现代企业管理；测控技术；机械工程实验（II）；机械控制工程理论基础；精密加工技术；流体传动与控制；生产实习；装备与制造技术基础；数控技术；机械工程计算方法；材料成形技术基础；现代加工。三、学科等级：机械制造及其自动化（080201）是二级学科名；一级学科名：机械工程（080200）。扩展资料：机械设计制造及其自动化毕业生应获得的知识和能力：1、具有较扎实的自然科学基础、较好的人文、艺术和社会科学基础及正确运用本国语言、文字的表达能力。2、较系统地掌握本专业领域宽广的技术理论基础知识，主要包括力学、机械学、电工与电子技术、机械工程材料、机械设计工程学、机械制造基础、自动化基础、市场经济及企业管理等基础知识。3、具有本专业必需的制图、计算、实验、测试、文献检索和基本工艺操作等基本技能。4、具有本专业领域内某个专业方向内所必要的专业知识，了解其科学前沿发展趋势。5、具有初步的科学研究、科技开发及组织管理能力。6、具有较强的自学能力和创新意识。参考资料来源：百度百科--机械工程参考资料来源：百度百科--机械设计制造及其自动化

原理是利用两个叶形转子在气缸内作相对运动来压缩和输送气体的回转压缩机。这种鼓风机结构简单，制造方便，广泛应用于水产养殖增氧、污水处理曝气、水泥输送，更适用于低压力场合的气体输送和加压系统，也可用作真空泵等。罗茨风机由：机壳、墙板、叶轮、油箱、消声器五大部分组成。机壳：主要起到支撑（墙板、叶轮、消声器）和固定的作用。墙板：主要用来连接机壳与叶轮，并支撑叶轮的旋转，以及起到端面密封的效果。叶轮：是罗茨风机的旋转部分，分两叶和三叶，但由于三叶的比两叶的出气脉动更小、噪声更小、运转更平稳等很多优点，已逐渐代替两叶罗茨风机。油箱：主要用于存放用来润滑齿轮及轴承的润滑油。消声器：用来减小罗茨风机的进、出时由于气流脉动产生的噪音。特性由于采用了三叶转子结构形式及合理的壳体内进出风口处的结构，所以风机振动小，噪声低。叶轮和轴为整体结构且叶轮无磨损，风机性能持久不变，可以长期连续运转。风机容积利用率大，容积效率高，且结构紧凑，安装方式灵活多变。机种齐全，可满足不同用户不同用途的需要。

在下午前面要用in

手影响我吃这个亏

你说的是在线仪表还是普通的离线台式表，在线的测量水体加药后的ORP,酸性高锰酸钾有很强的氧化性，只要通过蠕动泵加药，之后配合ORP电极反馈， 大概就这个样子 药师在详细就不知道了 我是修仪表不是做仪表的

midnight是品牌。midnight是一款珠宝首饰的品牌。midnight是海瑞温斯顿的midnight静夜系列珠宝。所以midnight是品牌。

我这边是大连的，NTT 大连，做手机软件的.加班费不多（几乎没有）待遇方面，看你是做啥职位。一般三年经验的话，测试能拿个5，6K吧，开发职位会高一些。如果是社招，一般随项目走，有项目时会招人。不会像校招那么固定 学到的基本上是工作流程，一般没有太多核心技术，但是这就足够了，因为在国内的外企都没有什么技术，如果你稍微有点基础，在一家混熟练了基本上到哪都可以胜任

yiru

机械工程和机械设计制造及其自动化区别：一、概念不同：1、机械设计制造及其自动化：是研究各种工业机械装备及机电产品从设计、制造、运行控制到生产过程的企业管理的综合技术学科。2、机械工程及自动化：以有关的自然科学和技术科学为理论基础，结合生产实践中的技术经验，研究和解决在开发、设计、制造、安装、运用和修理各种机械中的全部理论和实际问题的应用学科。二、课程设置不同：1、机械设计制造及其自动化：机械制造工艺学、机械系统设计、机电控制系统分析与设计、机械制造装备设计、数控技术及应用。高等数学、线性代数、概率论与数理统计、大学物理、大学物理实验、普通化学及实验、工程图学、理论力学、材料力学、电路基础。机械原理、机械零件、电子技术、互换性与技术测量、工程材料、金属工艺学、测试与传感技术、制造技术基础、液压与气动技术、机电传动控制、机械工程综合实验、微机原理与结构技术、CAD/CAM、单片机原理及应用。2、机械工程及自动化：工程力学、机械设计基础、电工与电子技术、微型计算机原理及应用、机械工程材料、制造技术基础。现代企业管理；测控技术；机械工程实验（II）；机械控制工程理论基础；精密加工技术；流体传动与控制；生产实习；装备与制造技术基础；数控技术；机械工程计算方法；材料成形技术基础；现代加工。三、学科等级：机械制造及其自动化（080201）是二级学科名；一级学科名：机械工程（080200）。扩展资料：机械设计制造及其自动化毕业生应获得的知识和能力：1、具有较扎实的自然科学基础、较好的人文、艺术和社会科学基础及正确运用本国语言、文字的表达能力。2、较系统地掌握本专业领域宽广的技术理论基础知识，主要包括力学、机械学、电工与电子技术、机械工程材料、机械设计工程学、机械制造基础、自动化基础、市场经济及企业管理等基础知识。3、具有本专业必需的制图、计算、实验、测试、文献检索和基本工艺操作等基本技能。4、具有本专业领域内某个专业方向内所必要的专业知识，了解其科学前沿发展趋势。5、具有初步的科学研究、科技开发及组织管理能力。6、具有较强的自学能力和创新意识。参考资料来源：百度百科--机械工程参考资料来源：百度百科--机械设计制造及其自动化

QQIP地址查询．有时候出出错的．．比如IP被分到了别的地方．而数据库没有更新．．那就显示错了．还有IP不一定准的．．人家使用代理上网的话．就可以显示别的地方的IP．．比如说我用上海别人的免费代理服务器上网．那我的IP也就会显示成上海的了实际我在山东

偶然的机会参加了学校的“千人留学计划”，通过面试后顺利进行为期半年的交换生生涯。我选择的大学是台湾元智大学，因为学中文的缘故，并没有选择到欧洲国家，想到台湾感受更多的中华文化和不同之处。 我当时是因为人数没有凑够而补交的申请，如果没有第二次留意的话就错失了这次机会。其实在校园中有各种各样的活动和交换计划，比如有出国见习，出国交换，出国交流，以及到985 211等院校交换，活动方面还有很多省级和国家级的比赛，比如“挑战杯”，大学生创业竞赛......等等。 同学们要多加留意校园里的留学计划和活动。比赛不仅能够加学分，还能丰富你的经历，从中得到的锻炼。 那么当一次交换生也可以丰富你人生的阅历，俗话说“读万卷书不如行万里路”，书本上的知识让我们了解世界，而行走在路上让我们看见世界，拥抱世界，获得无法附加的人生和宝贵的记忆财富。 无论到了哪一个新的环境，总有矛盾的心理状态，我们称之为——忐忑不安。忐忑的是自己终于到了一个新的环境，比过去的自己厉害了那么一点，却不知道自己在这个全新陌生的环境里将会面临什么；不安是源自对未知的恐惧，就像明天和意外你不知道哪个先来。 也正是因为这样的缘故，所以劝大家多出门看看。及时行乐大抵不该被认为是灯红酒绿，莺歌燕舞，纸醉金迷或放纵自我，而是把握时机做自己想做的事，追自己想追的梦，看见更清晰更真实的世界，在行走中记忆，在行走中感受，在行走中体会生活。 不要因为家里的束缚就变成按部就班的书呆子，不要因为父母的担心就不远游，俗话的正解是“父母在，不远游，远游必有方”。 过去的交通不便利，人也固守家乡，外婆担心我一个女孩子在外人生地不熟，说别瞎折腾。可外公要是还活着，大抵会支持我各地游历，他总想让我闯荡一点。 人只活这么一次，如果不多了解一点，不多记住一点，不多积累一点，等哪天回头看的时候，大概会遗憾才走了那么短短的几步。 前段时间网上传一个段子：一个老板打电话说大学生有什么用，还不是给我打工，前面买票的大学生听见了便把自助端改成了英文版。 虽然成为谈资大家一笑而过，可文化这个东西的确是潜移默化的，所谓“腹有诗书气自华”。 三毛也说过：读书多了，容颜自然改变，许多时候，可能自己看过的书籍都成过眼烟云，不复记忆，其实它们仍然潜在气质里、在谈吐上、在胸襟的无涯，在精神的深远。当然也可能显露在生活和文字中。 游学大概也是这样的效用。在游学的过程中我们不是一个只会购物和发朋友圈炫耀的“贵妇”，我们在校园感受学生的不同，感受教学方式的不同。感受不同文化环境下的人群和气氛。 在熙熙攘攘的街道感受拿着咖啡赶路的白领，抱着孩子的母亲和穿着校服成群结伴回家的学生。我们关注等红绿灯和闯红绿灯的情况，我们关注商店服务员的态度，我们关注周围人的眼光，我们关注街道上没有垃圾桶也没有垃圾...... 我在一家咖喱饭餐厅吃饭，出门时看见刚才为我们服务的服务员蹲坐在墙角，穿着黑色衬衣和酒红色围裙的工作服，抽着烟。她一头干净利落的短发，长得格外清秀帅气，让我不住多瞥了几眼。台北的夜景在她身后像巨大幕布，她在餐厅二楼忙里偷闲享受一刻钟的惬意。 这让我突然联想到每个人在这一分钟都在做些什么？一百个人有一百种人生，你在世界的哪个角落，你在做着什么，又有谁正过着你想要的生活？ 而此时此刻的我在台湾看夜景和夜景下的你，写下了这段话，不像普通的游客谈论着餐食多美味，接下来去哪里购物。 这是我游学经历里可以称为美妙的事了，看见世界，拥抱世界。

罗茨鼓风机叶轮和气室制造特点间隙小，尺寸精密，利用叶轮快速旋转，把空气从出风口排出，从入风口吸入。 福建春鼎

这是因为这些暖宝宝当中存在着一定的化学物品，而这种化学物品也是可以发热的，然后也可以保持比较长时间的温度。

院校专业：基本学制：四年 | 招生对象： | 学历：中专 | 专业代码：080202培养目标培养目标 培养目标：本专业培养具备机械设计制造基础知识及应用能力，能在机械制造领域从事设计 制造、科技开发、应用研究、运行管理等方面工作复合型高级工程技术人才。培养要求：本专业学生主要学习机械设计、机械制造、机械电子及自动化等方面的基础理论 和基本知识，接受现代机械工程师的基本训练，具有机械产品设计、制造、设备控制及生产组织管 理等方面的基本能力。毕业生应获得以下几方面的知识和能力：1．具有数学及其他相关的自然科学知识，具有机械工程科学的知识和应用能力；2．具有制订实验方案，进行实验、处理和分析数据的能力；3．具有设计机械系统、部件和工艺的能力；4．具有对于机械工程问题进行系统表达、建立模型、分析求解和论证的初步能力；5．初步掌握机械工程实践中的各种技术和技能，具有使用现代化工程工具的能力；6．具有社会责任感和良好的职业道德；7．具有团队合作精神和较强的交流沟通能力；8．具有国际视野、终身教育的意识和继续学习的能力。主干学科：力学、机械工程。核心知识领域：机械设计原理与方法（含形体设计原理与方法、机构运动与动力设计原理、 结构与强度设计原理与方法、精度设计原理与方法、现代设计理论与方法）、机械制造工程原理 与技术（含材料科学基础、机械制造技术、现代制造技术）、机械系统中的传动与控制（含机械电 子学、控制理论、传动与控制技术）、计算机应用技术（含计算机技术基础、计算机辅助技术）、热 流体（含热力学、流体力学、传热学）。核心课程示例：1．示例一：工程制图（40+32学时）、材料力学（56学时）、理论力学（60学时）、机械原理(56 学时)、机械设计（56学时）、电路理论（40学时）、模拟电子技术（40学时）、数字电路（32学时）、 微机原理（40学时）、机电传动控制（64学时）、工程材料学（32学时）、机械制造技术基础（40学 时）。2．示例二：理论力学（64学时）、材料力学（64学时）、机械工程制图（48 +64学时）、机械原 理（64学时）、机械设计（64学时）、电工技术基础(64学时)、电子技术基础（64学时）、工程材料 （32学时）、热工基础（48学时）、机械制造技术基础（64学时）、控制工程基础（48学时）。3．示例三(1)工程机械方向：机械制图（32+48学时）、机械原理（48学时）、机械设计（48学时）、发动 机构造与原理（32学时）、液压与液力机械传动（48学时）、工程机械底盘（40学时）、现代工程机 械（48学时）、工程机械设计（32学时）、工程机械运用技术（32学时）。(2)机电一体化方向：机械制图（32+48学时）、机械原理（48学时）、机械设计（48学时）、控 制工程基础（40学时）、机械电子学（48学时）、机制工艺学（48学时）、机电传动控制（40学时）、 液压传动（40学时）、CAD/CAM（40学时）。主要实践性教学环节：金工实习、电工（电子）实习、认识实习、生产实习、课程设计、科技创 新与社会实践、毕业设计（论文）。主要专业实验：工程力学实验、机械设计基础实验、互换性测量技术基础实验、工程测控实 验、电工与电子技术实验、机械制造基础实验、机电传动与控制实验。修业年限：四年。授予学位：工学学士。 职业能力要求职业能力要求 专业教学主要内容专业教学主要内容《C/C++程序设计》、《机械CAD/CAM》、《AUTO CAD 二维绘图与三维造型》、《电路与模拟电子技术》、《数控技术及应用》、《机械精度设计》、《机械拆装与测绘》、《自动化制造系统》、《机械精度设计基础》、《自动化机械系统设计》 部分高校按以下专业方向培养：车辆、机辆工程、汽车运用、数控技术、机电一体化、机械新技术、机械设计制造、精密制造技术、机电传动与控制、制造自动化与测控技术。专业（技能）方向专业（技能）方向机械、技术类企业：机械设计、机械制造、控制设备的维护维修、数控机床的编程及操作、工艺工装的设计制造、机械CAD/CAM技术、现场技术管理。职业资格证书举例职业资格证书举例 继续学习专业举例 就业方向就业方向 发展前景：（1） 从事机械设计与制造加工工艺规程的编制与实施工作；（2） 从事机械、电气、液压、气压等控制设备的维护维修工作；（3） 从事工艺工装的设计、制造工作；（4） 从事数控机床、加工中心等高智能设备的编程及操作工作；（5） 从事机械CAD/CAM技术的应用工作等； 对应职业（岗位）对应职业（岗位） 其他信息：机械工程及其自动化的就业方向包括从事设计制造、科技开发、应用研究、运行管理和经营销售等方面工作的高级工程技术人才。 机械设计制造及其自动化是研究各种工业机械装备及机电产品从设计、制造、运行控制到生产过程的企业管理的综合技术学科。以机械设计与制造为基础，融入计算机科学、信息技术、自动控制技术的交叉学科，主要任务是运用先进设计制造技术的理论与方法，解决现代工程领域中的复杂技术问题，以实现产品智能化的设计与制造。 具体就业方向： 从事机械设计与制造加工工艺规程的编制与实施工作； 从事机械、电气、液压、气压等控制设备的维护维修工作； 从事工艺工装的设计、制造工作； 从事数控机床、加工中心等高智能设备的编程及操作工作； 从事机械CAD/CAM技术的应用工作； 从事机械设计与制造的现场技术管理工作； 从事机电产品的销售和服务工作； 在高等学校、科研机构和国家机关从事教学、科研和行政管理工作； 从事机械模具设计生产及制造相关工作。

1号midnight是2号凌晨。midnight是指结束晚上，11点到凌晨1点。midnight　英 ["mu026adnau026at] 　 美 ["mu026adnau026at] 　 　n. 午夜；漆黑We finally got some shut-eye after midnight.午夜过後我们总算睡了一会儿。反义词midday　英 [u02ccmu026ad"deu026a] 　 美 [u02ccmu026ad"deu026a] 　 　n. 正午；中午We have finished work at midday.我们已于正午完成任务。

你应该让你的路由器拨号上网，即路由器的wan口不能配置静态 的IP地址，应改为pppoe，并设置相应的账号和密码，这两个参数应该找你的宽带接入运营商要。拨号成功后，运营商网络上的服务器会给你的路由器分配一个有效的IP地址的。

Mclaren迈凯伦商务酒店(邢台二十三中第五医院店)地址：桥西区建设大街589号邢台Mclaren迈凯伦商务酒店地处邢台桥西区建设西路，周围餐饮、购物等生活配套齐全，出行便利。是集住宿、餐饮、会议为一体的综合性商务酒店。酒店拥有豪华套房、亲子房、豪华大床房、双床房、行政大床房等多种房型。外观时尚，整体装饰精致典雅，拥有宽敞亮丽的大堂；客房布置舒适温馨、通风采光，是您出差旅行的绝佳！

广州VRP微型蠕动泵市场占有率正在明显提升！

midnight barcelona

　　一、基本结构　　燃气热水器一般包括：外壳、给排气装置、燃烧器、热交换器（俗称水箱）、气控装置、水控装置、水气联动装置和电子控制系统等。　　具体结构组成主要如外壳、面壳、开关旋钮、烟管（强排烟管）、风扇电动机（可选）、风压开关、热交换器、温控器、燃烧器、水气联动阀门、电磁阀、排风罩、点火机、离子火焰感应针、脉冲发生器、底壳固定板、电控器、底壳等。　　家用燃气热水器的控制系统是一个电子控制系统，一般带有一个火焰检测装置和一个控制装置。控制系统具有电子点火、熄火保护、安全中断、出水恒温、过热保护、不完全燃烧保护功能，还具有再点火、人机电话显示、报警功能和遥控功能，燃气热水器有时序控制器、数字控制器和模糊控制器三种。　　燃气热水器的感应元器有水流量传感器、离子火焰感应器、温度传感器、热电偶、微动开关、干簧管、霍尔传感器等。其作用是将反应热水器工作情况的有关信息转换成电信号，以便实现对热水器工作状态的控制。　　二、内部结构　　1、集烟罩：顾名思义，收集烟气专用。冷凝式产品的集烟罩较长，并且被进水管包围，这样用烟气的热量预热了冷水。　　2、底壳：没什么好说的，固定内部配件和挂墙专用。　　3、CO报警装置：有的产品是自带的，有的产品没有。　　4、加热防冻保护装置：这个保护装置的原理就是一个电加热丝，一旦检测到环境温度达到冰点，立即开始加热，保护水箱不被冻坏。　　5、燃烧器：火排在里面，不锈钢制成。　　6、分配器：就是咱们前面说的分段燃烧，就是用这个控制的，一个电磁阀控制一段火焰。　　7、比例阀：调节燃气输出的比例，以前的机械式旋钮产品没有这个，那个是用的水气联动控制的。　　8、风机：将空气鼓入燃烧室内，这张图是强鼓式的，强抽式的产品只不过风机在顶端，效果就是强鼓式的鼓风强些，抽烟弱些，强抽式的反之，我个人更喜欢强鼓式产品。　　9、温度传感器：检测出水温度。　　10、出水接头：连接热水软管。　　11、泄压放水塞：可以将内部的残留的水放掉。　　12、电源插头：大家尽量选择带漏电保护器的产品。　　13、进气接头：连接高气管。　　14、进水接头：连接冷水软管。　　15、调水旋钮：可以调节进水的大小。　　16、水量传感器：是由霍尔传感器和水流转子组件构成。　　17、变压器：调节到合适的电压供给电机和内部电路使用。　　18、点火器：这个其实也相当于调试器。　　19、点火针：前面很尖，电离空气产生火花从而点燃燃气。　　20、感应针：检测火焰是否燃烧。　　21、控制器：里面有电路板和电子元件，用来实现自动控制。　　22、热交换器：又称为水箱，但它不储水，铜制的最好，由盘管、翅片和外壳组成。　　23、防干烧温控器：当温度超过限定温度后，就会自动断开电路。　　24、防冻温控器：当温度低于限定温度后，就会自动断开电路。

罗茨风机是一种高压风机，罗茨风机为容积式风机，输送的风量与转数成比例，把气体由吸入的一侧输送到排出的一侧。　　罗茨风机的原理，有点类似齿轮油泵。风机的两个转子近似两个8字，转子以这种复杂的曲线外形，不间断的互相封闭进出口处的压力差，而由转子和机壳之间把气体送到高压区。这种转子外形的曲线，就是罗茨风机的奇妙之处。　　炼铁高炉的鼓风需要较高的压力，所以炼铁的鼓风，是罗茨风机的主要用途之一。　罗茨真空泵的最大优点是在较低入口压力时具有较高的抽气速率，但它不能单独使用，必须有一台前级真空泵串联，待被抽系统中的压力被前级真空泵抽到罗茨真空泵允许人口压力时，罗茨真空泵才能开始工作，并且在一般情况下，罗茨真空泵不允许高压差时工作，否则将会过载和过热而损坏，因此使用罗茨真空；泵时必须合理地选用前级真空泵，安装必要的保护设备。　　前级真空泵一般为油封机械泵，但如果极限压力要求不高时，可选用其他形式的粗真空泵作为前级泵。特别在抽除有大量水蒸汽的气体时，选用水环真空泵作为前级泵是很理想的，当然所能达到的极限压力要差些。参考文献：转载汇编

PS是哪个公司的？它是干什么的？ PS是PHOTOSHOP的简称,它是美国Adobe公司的产品。 Photoshop是目前公认的最好的通用平面美术设计软件，它的功能完善，性能稳定，使用方便，所以在几乎所有的广告、出版、软件公司，Photoshop都是首选的平面工具。 功能：是专门用来进行图像处理的软件。通过它可以对图像修饰、对图形进行编辑，以及对图像的色彩处理，另外，还有绘图和输出功能等。 在实际生活和工作中，我们可以将数码照相机拍摄下来的照片进行编辑和修饰；也可以将现有的图形和照片，用扫描仪扫入计算机进行加工处理；还可以把摄像机摄入的内容转移到计算机上，然后用它实现对影像的润色。总之，PhotoShop 可以使你的图像产生特技效果，如果和其它工具软件配合使用，还可以进行高质量的广告设计、美术创意和三维动画制作。由于PhotoShop功能强大，目前，正在被越来越多的图像编排领域、广告和形象设计领域以及婚纱影楼等领域广泛使用，是一个非常受欢迎的应用软件。 Photoshop支持几乎所有的图像格式和色彩模式，能够同时进行多图层的处理；它的绘画功能和选择功能让编辑图像变得十分方便；它的图层样式功能和滤镜功能给图像带来无穷无尽的奇特效果 记得采纳啊 NTT是哪个国家的公司，另外它是干什么的 NTT DOCOMO是全球领先的移动通讯公司，向5千多万客户提供服务。公司提供具领先优势的多元化多媒体服务，包括全球最受欢迎的移动网际网络服务商i-mode(R)，向4,500多万用户开通电子邮件和网际网络通讯；FOMA(R)于2001年推出，是全球第一项以W-CDMA为基础的3G移动通讯服务。除了在欧洲、北美和亚洲拥有全资子公司，NTT DoCoMo 目前正积极通过与亚太区以及欧洲的移动通讯和多媒体服务商建立战略伙伴关系，以拓展其全球业务。 求采纳 艾润活力氧是哪个公司的？那个公司是干什么的？ 西安艾润科技发展有限公司注册成立于2006年9月30日，位于国家级西安高新技术产业开发区，一期投资资本人民币1600万元。公司现有员工116名，内部组织机构建设完善，下设人事行政部、财务部、营销部、生产技术部、质控部、采供部和研发部，覆盖全国的北京、上海、广州、西安、拉萨、成都六大分公司，为产品研发生产、市场拓展铸就了一支团结和谐的队伍。 在董事长的带领下，艾润人顽强拼搏、勇于创新，在不到一年的时间内，高质量、高标准建成了国际一流的艾润活力氧生产线，具备了年产艾润活力氧便携式氧气呼吸器1000万罐的生产能力，为企业的发展奠定了良好的基础。 艾润科技拥有国际化标准厂房与世界一流的自动控制作业线，设备选用德国、英国、美国、日本等国家的顶尖产品。生产的艾润活力氧便携式氧气呼吸器，经各项技术指标检测，艾润活力氧纯度达到99.6%以上，达到国际同类产品领先水平。艾润活力氧便携式氧气呼吸器具有体积小、容量大、重量轻、便于携带、使用方便等特点，得到了消费者的认可与广泛赞誉，填补了同类产品在国内的技术空白。 展望未来，公司决心在做好现有市场的基础上，立足国内，迈出国门，不断创新，勇往直前，为人类健康做出更大的贡献。 马化腾是哪个公司的?干什么的 马化腾，男，1971年10月29日生于广东省汕头市潮南区。 马化腾是腾讯公司主要创办人之一，现担任腾讯公司控股董事会主席兼首席执行官。 马化腾是腾讯公司董事长，也腾讯公司董事会的代理人。执行董事会授予的经营管理权利，马化腾是公司政策执行机构的最高负责人。 CEO它是干什么的？ 首席执行官（Chief Executive Officer，缩写CEO）是在一个企业中负责日常经营管理的最高级管理人员，又称作行政总裁（香港和东南亚的称呼）或最高执行长（日本的称呼）。 CEO的主要职责是： 一，对公司的一切重大经营运作事项进行决策，包括对财务、经营方向、业务范围的增减等； 二，参与董事会的决策，执行董事会的决议； 三，主持公司的日常业务活动； 四，对外签订合同或处理业务； 五，任免公司的高层管理人员； 六，定期向董事会报告业务情况，提交年度报告。 CEO的其他职责还可以包括树立、巩固或变更企业文化，团队建设等等。 成都道勤管理顾问服务有限公司（acmchn.）提供 谁知道057111831155这个号码是哪个公司的 干什么的 您好，可以在手机上查，一般手机都有显示归属地信息功能。如果手机没有自带安装的软件。可安装下载一个类似搜狗号码通的软件或者来电通之类的软件，这类软件一般是可以查询固定电话及手机，还有标记功能，能看出推销电话、地址电话、电话种类的，如果软件也无法查询具体的地址和什么行业电话那么就可能是来自某种网络电话、VoIP电话、网关电话; 有些软件可以修改手机或者电话拨出的显示号码，让接听者无法知道来源; 温馨提示：这种来历不明的电话：建议不要接听，可能是某骗子的电话，对于这种电话谨慎处理。 说什么电信客服代表，其实做业务推销的 阿达迪斯是哪个国家的？它是干什么的？ 阿迪达斯是德国运动用品制造商 阿达迪斯公司为阿达迪斯集团的控股公司，是欧洲重要的烟草制造商，同时也是世界第六大烟草公司，其雪茄业务在全球排名第一，卷烟业务在西欧地区排名第三。阿达迪斯的业务遍及全球30多个国家和地区，全球雇员2.74万人。 运输公司的调导是干什么的 航运公司的调导： 负责船员的调配、考核以及劳动安全日常管理工作。 负责按船舶配员有关规定为每艘船舶配备合格、持证和健康的船员。 按公司有关规定负责船员的调配和管理工作，负责审核大副、大管轮及以下干部船员调配并做好船员上船前的谈话工作。 根据国际公约、国家法规、公司的培训要求，负责对船员培训的选派并对培训期间的船员实施跟踪和管理。 负责船员日常考核、晋升考核、职称申报和聘任的申报管理工作。 根据海事局船员证件管理规定以及公司的船员证件管理规定，负责对在船船员证件跟踪管理。 根据国家、总公司和公司的有关法规及规定，负责船员的奖惩建议。

我觉得忙是一方面，另一方面可能是不想和她一起过情人节吧。