细胞

线粒体和叶绿体中有DNA.

细胞质基因组（plasmon）是细胞质中基因的总称，而细胞质基因是指细胞质中存在的一个个基因。在细胞质基因中，凡存在于色素体中的称为质体基因，存在于线粒体中的称为线粒体基因等，从线粒体、叶绿体等小细胞器中曾经分离出被染色体那样的dna。

细胞质基因组（plasmon）是细胞质中基因的总称，而细胞质基因是指细胞质中存在的一个个基因。在细胞质基因中，凡存在于色素体中的称为质体基因，存在于线粒体中的称为线粒体基因等，从线粒体、叶绿体等小细胞器中曾经分离出被染色体那样的DNA。

核DNA数目少于细胞中DNA数目，也可以说后者包含前者

细胞核中染色体含DNA

诱导细胞分化可以用小分子化合物，其优点就是定向指定分化方向。比如安捷凯生物医药提供的Purmorphamine能诱导全能细胞分化成骨，其原理是作用于Hedgehog（Hh）信号通路，导致其下游靶基因的上下调节，包括Gli1和Patched，最终可用于治疗骨相关疾病和神经退行性疾病，关于Purmorphamine诱导分化成骨详细介绍见Purmorphamine详细介绍。具体要看您需要诱导哪方面的分化，不过试剂公司提供的产品都是只用于实验，类似的产品很多，详细请见安捷凯生物医药

你好，我给你看下这里你就明白了。红细胞凝集的现象。有由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的红细胞凝集。（1）由病毒而引起的凝集：G．H．Hirst（1941）发现流感病毒能使鸡的红细胞发生凝集，其后又发现其它各种病毒也能引起同样的红细胞凝集反应。即红细胞表面存在着对各种病毒的受体，病毒与受体结合，以红细胞为桥梁的结果而引起凝集。利用此反应可以进行病毒的定性和定量。另外，如果存在抗病毒的抗体时，则由病毒引起的凝集作用将被抑制，所以可用于抗病毒抗体的检出。（2）由抗体引起的凝集：（a）如果存在对红细胞表面决定基的抗体，则红细胞亦将凝集。可用于测定对抗红细胞的抗体的效价或鉴定人的血型。（b）在红细胞表面，如果人为地使之吸附或结合特定的抗原物质，则与该抗原相对应的抗体将引起红细胞凝集（被动凝集反应或间接凝集反应，psssive he-magglntination）。　　血凝及血凝抑制试验　　有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

应该是盐，发生化学作用。

指红细胞凝集的现象.有由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的红细胞凝集. （1）由病毒而引起的凝集：G．H．Hirst（1941）发现流感病毒能使鸡的红细胞发生凝集,其后又发现其它各种病毒也能引起同样的红细胞凝集反应.即红细胞表面存在着对各种病毒的受体,病毒与受体结合,以红细胞为桥梁的结果而引起凝集.利用此反应可以进行病毒的定性和定量.另外,如果存在抗病毒的抗体时,则由病毒引起的凝集作用将被抑制,所以可用于抗病毒抗体的检出. （2）由抗体引起的凝集：（a）如果存在对红细胞表面决定基的抗体,则红细胞亦将凝集.可用于测定对抗红细胞的抗体的效价或鉴定人的血型.（b）在红细胞表面,如果人为地使之吸附或结合特定的抗原物质,则与该抗原相对应的抗体将引起红细胞凝集（被动凝集反应或间接凝集反应）

没有细胞病变和红细胞吸附现象的病毒有哪些指红细胞凝集现象由病毒、细胞凝集素抗体引起红细胞凝集 (1)由病毒引起凝集:G.H.Hirst(1941)发现流病毒能使鸡红细胞发凝集其发现其各种病毒能引起同红细胞凝集反应即红细胞表面存着各种病毒受体病毒与受体结合红细胞桥梁结引起凝集利用反应进行病毒定性定量另外存抗病毒抗体则由病毒引起凝集作用抑制所用于抗病毒抗体检 (2)由抗体引起凝集:(a)存红细胞表面决定基抗体则红细胞亦凝集用于测定抗红细胞抗体效价或鉴定血型(b)红细胞表面使吸附或结合特定抗原物质则与该抗原相应抗体引起红细胞凝集(凝集反应或间接凝集反应)

维生素d和巨噬细胞toll样受体结合，怎样诱导微生物多肽表达巨噬细胞（Macrophages）能够吞没、破坏受损伤组织，有助于启动康复过程。虽然它们在损伤位点发挥关键作用，但一旦任务完成，就需要尽快撤离，结束炎症反应，为再生过程开路。继续存在的巨噬细胞不利于组织恢复。尽管研究人员对于启动巨噬细胞的分子机制研究的比较透彻，但关于其退出损伤位点的过程还了解甚少。研究人员鉴别出一清除外周神经损伤位点巨噬细胞的关键环节，对弄清脊髓损伤、中风和多发性硬化中相似的分子机制提供了重要线索。已知Nogo细胞受体家族与神经细胞生长有关，SamuelDavid等观测Nogo家族成员NgR1的作用。NgR1类受体是位于细胞膜上的蛋白开关，受到特异化学信号或配体刺激后，诱导细胞反应。破坏大鼠、小鼠的大腿坐骨神经，观察NgR1在修复过程中的作用，结果发现巨噬细胞到达损伤位点后，细胞表面会表达NgR1。进一步研究发现，受损神经合成髓磷脂时，NgR1不仅阻止巨噬细胞与髓磷脂结合，而且直接排斥正在形成过程中的髓磷脂，若抑制髓磷脂再生，巨噬细胞会停留在损伤位点周围。最终，研究人员在髓磷脂上鉴别出特异激发排斥反应的分子。可应用于外周神经以外的神经（中枢神经），他们发现中风、多发性硬化和脊髓损伤过程中激活的巨噬细胞，表面都会表达NgR1。

没有什么问题，放心。就是上一次手术的术后反应，正常。

HeLa细胞即人宫颈癌细胞，只有一种HeLa是第一个来自人体组织经连续培养获得的非整倍体上皮样细胞系，它由GeyGO等在1951年从31岁女性黑人的宫颈癌组织建立。经原始组织切片重新观察，Jones等将其诊断为腺癌。已知该细胞系含有人乳头状瘤病毒HPV18序列，需在2级生物安全防护台操作。该细胞角蛋白阳性，p53表达量较低，但表达正常水平的pRB（视网膜母细胞瘤抑制因子）。细胞别称：HELA;He-La; HeLa-CCL2; Henrietta Lacks cells; Helacyton gartleri细胞来源：宫颈细胞形态：上皮细胞样生长特性：贴壁生长安全等级：BSL2包装规格：T25瓶或者1mL冻存管包装倍增时间：2~3天传代比例：1:3保藏机构：ATCC; CCL-2；ATCC; CRM-CCL-2；CCTCC; GDC0009；JCRB; JCRB9004；

网上就有呀，还来这里提问做甚？费解！

Hela细胞源自一位名叫Henrietta Lacks美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞系。这名美国妇女在1951年死于该癌症。为了让拉克斯保持匿名，此细胞株原宣称是依“Helen Lane”命名。

hela细胞是一种癌细胞，是人类第一次从一个叫hela的癌症患者身上分离出来的细胞，由于癌细胞能够无限增殖，因此被看作不死，但是实质上当营养不足受到化学药物攻击时，癌细胞也会发生凋亡。

关于CicelyMaryBarker身份:英国著名的女画家出生地:66WaddonRoadinCroydon,Surrey,England家庭背景:家中的小女儿,有一个大她两岁的姐姐——DorothyOswaldBarker。父亲WalterBarker,是一个业余的艺术家(apartnerinaseedsupplycompanyandanamateurartist),母亲MaryEleanor(Oswald)Barker。儿时患有癫痫症(epileptic),无法上学,只能在家接受教育,并通过阅读和绘画消磨大部分时间。KateGreenaway和RandolphCaldecott对她后来作品影响很大。LifeLine:1895年6月28日,出生在英国(Croydon,Surrey,England)1908年,Cicely13岁时,她的父亲参加了Croydon艺术社团,她也因此学习了专业的艺术课程。参加了theCroydonSchoolofArt的晚间课程(eveningclass)15岁时,她的花仙作品就被刊登在杂志、贺卡和明信片上。1911年RaphaelTuck&SonsboughtfourofBarker"s"littledrawings"forhalfasovereign,[3]andpublishedthemaspostcards.作品被买下并出版,时年16岁。同年十月,她赢得了一个海报比赛(theCroydonArtSociety"spostercompetition)的第二名,被吸纳成为Croydon艺术社团中最年轻的成员。InOctober1911,shewonsecondprizeintheCroydonArtSociety"spostercompetition,andshortlyafterwardwaselectedtheyoungestmemberoftheSociety.[2]1912年6月,她的父亲离世了。17岁的玛丽巴克向杂志投稿,用她的画作努力地支撑着母亲和姐姐的生活。Inthelate1920s,Barkerbegantodoubtshewasdoingenoughforthechurchandconsideredfocusingsolelyonsacredworks.Familyandfriendsrecommendedshecontinuesecularandsacredworks,whichshedid.[8]BarkercontinuedtoattendeveningclassesattheCroydonArtSchoolbetweenthe1920sandthe1940s,eventuallyreceivingateachingposition.ShetooksketchingtripstoAmberleyandStorringtoninSussexandtoCornwallandthesoutherncoastwithfamilyandfriends.ShevisitedandstayedwithartistMargaretTarrantinGomshall,SurreyandwithfamilyinUgglebarnby,NearWhitby,NorthYorkshire.In1940,theBarker"slive-inmaidretired,andDorothyBarkerclosedherschoolatthebackofthehouseinTheWaldrons.Shecontinuedtosupervisethehousehold,andtogivebothhermotherandsisterthecaretheyneeded.Dorothyandhersistercollaboratedupononlytwobooks:OurDarling"sFirstBookandtheChristian-themed,HeLeadethMe.In1954DorothyBarkerdiedofaheartattack.Barkerwasunabletopursueherarttoanysignificantextentfollowinghersister"sdeath,asallthecareofheragedmotherdevolveduponher,butshedidmanagetobeginplanningastainedglasswindowdesigninhersister"smemoryforSt.Edmund"s,Pitlake.[9]1923年,她的画作《flowerfairiesofthespring》正式出版。更多人喜欢了她的花仙子。玛丽巴克同时开始了字母表精灵的创作。每个字母都会有一个对应的花仙,孩子们如此喜爱这些花精灵。这成为了玛丽巴克最为重要的创作。直到现在孩子们还在使用这些带有花仙精灵的字母表。Cicely随后绘制了更多花仙系列:FlowerFairiesoftheSummer、FlowerFairiesoftheAutumn、FlowerFairiesoftheWinter、FairiesoftheTrees、FlowerFairiesoftheGarden、FlowerFairiesoftheWayside、TheFlowerFairyAlphabet。除了花仙系列,Cicely也为童书绘制了插画,如ALittleBookofOldRhymes、GroundselandNecklaces、以及TheLordoftheRushieRiver等。现在,除了印刷品外,Cicely的小花仙还被制作成各种礼品像框、瓷偶、水晶球等摆。花仙图案也在DIY的立体纸雕和十字绣等出现。In1924,thefamilymovedintoafour-level,semi-detachedVictorianhouseat23TheWaldrons.第二次世界大战爆发,世界上成百上千万的儿童流离失所,玛丽巴克的花仙子带着治愈的翅膀,从英国的伦敦飞到了世界各地。玛丽巴克用一个花仙子的梦治愈了全世界的儿童。画中明丽的色彩,和欢乐的氛围,给予了每个孩子希望和憧憬。那些惨烈的画面逐渐淡没在她的画中。童年时,Cicely非常喜欢KateGreenaway插画中的仙女,喜欢画精灵花仙。她的花仙是一群有着各色蝴蝶翅膀的人间儿童,带着笑意在花丛中嬉戏。无论画的是哪个季节,画面色彩总是带着旧气的暖色调,一如深藏人心的美好传说。疾病使她不能像其他的孩子一样,到学校里去读书。病中的玛丽巴克,渴望享受集体生活和知识殿堂带来的心灵愉悦。但生活的残酷让这个愿望成为了她一生不能实现的一个梦想。她的父亲,钟情绘画,是croydon艺术团的成员。良好的家庭熏陶,给予了玛丽巴克最好的绘画启蒙,父亲为她请了家庭女教师,玛丽巴克得以在家中完成学业。此时玛丽巴克喜欢上了凯特.格里纳韦(KateGreenaway)的童书插画,她被这位维多利亚时代最著名的插画师,图文并茂的绘画形式吸引,同时内心被这些画的清新优雅感染。玛丽巴克喜欢绘画,疾病使她不能拥有自由的童年,绘画却以另一种形式打开了她心灵深处的另一扇大门。她的脑海中总是飘飞着一些美丽的精灵,他们长着美丽的翅膀,在花间飞舞,他们都有阳光灿烂的容颜,在玩耍嬉戏,天真烂漫。这可能是世界上最动人的图画了!玛丽巴克开始了她的花仙子人生之旅。她想把这些精灵画了下来。父亲支持她的想法,带她到一所专业学校,学习了一段时间。热爱让玛丽巴克忘却了病痛,花中的精灵们在她的笔下一个个诞生。他们的眼睛里映上世界的甜美,他们和她似乎在说话,感谢她把他们创造的这么美,他们也向看过他们的人们询问为什么你不开心,他们告诉这个世界,快乐是人生的源泉。1973年2月16日,MaryBarker在她的故乡逝世。直到现在全世界都还在使用这些花仙子的梦境。皮包,陶瓷,琉璃,花仙子们永恒的治愈着世界。这就是玛丽巴克的故事,命运给予了她缺陷,她却用深情相拥治愈了全世界,让她和别人都成为完美。那么以此献给玛丽巴克和她的花仙子吧!原文链接:CicelyMaryBarker-Wikipedia,thefreeencyclopedia官网——FlowerFairies·Newwebsitecomingsoon参考文献BibliographyLaing,Jane(1995),CicelyMaryBarkerandHerArt,FrederickWarne&Co.,ISBN0-7232-4051-5当下最红、最引人注目的时尚插画在此！当红时尚插画师HelenDownie作品时尚插画作为元老级视觉传达媒介,在新时代不仅没有停止发展,更衍生出了许多风格迥异的新表达形式。当下最红、最引人瞩目的时尚插画师及其作品,你知道几个?时尚插画的黄金时代早期,时尚插画与时尚杂志的倾力合作促成其进入过一个全盛时期。那时的杂志从封面到内页几乎无一例外地需要使用插画做配图。那时的读者是从一幅幅精美的插画中接收时尚、艺术、品位等信息的。可以说,那时的时尚杂志与时尚插画是互相成就的关系。Harper"sBazaar杂志封面时尚插画与时尚品牌的碰撞到了数码时代,摄影作品已成为杂志刊物的主要视觉传播源。虽然以时尚插画为主要宣传媒介的杂志时代已终结,但时尚插画行业并未因此沉睡,而是朝着新方向不断发展、进化着。时尚插画与时尚品牌合作,便是当下发掘出的最成功的新道路。Gucci作为时下最具话题性的品牌,经常在社交媒体里搜寻一些当红插画师进行合作。以下这些充满色彩、富有诗意的作品都是插画师HelenDownie创作的。值得一提的是,这位极具专业水准的插画师其实是一位非科班出身的主妇,她的传奇经历与她的画作同时走红网络。再加上她的作画风格与Gucci推崇的新美学理念出奇相似,让品牌创意总监一眼就相中了她的作品并展开了一系列的深度合作。HelenDownie作品虽然已是一位母亲,但是她天马行空的作品中总是流露出些许少女的纯真感。尤其是画作人物中那一双双天真的大眼睛,奇特又充满童趣。HelenDownie作品然而,这并不是Gucci第一次与时尚插画师合作了。早前,此品牌还曾邀请另一位插画师AlexMerry展开过一次更“艺术式”的合作。从纽约到伦敦、米兰到上海,凡是有艺术墙的城市几乎一夜间被Alex这些创意十足的时尚插画作品所占据。这样巨型时尚插画作品如此呈现,实属罕见,所以当艺术墙面的图片一发布,立刻就引起了网络上的一阵骚动。AlexMerry作品除此之外,Gucci还将插画作品中的产品制作出来售卖,让所有为之心动的消费者都能找到并拥有这些产品。他们将这些梦幻般的理想产物变为了现实。另一方面,观者从这些浪漫主义风格的时尚插画作品可以看出,时尚插画的风格早已不再单一。AlexMerry作品说起时尚插画与品牌的跨界合作,那就不得不提Prada。在2018年男装春夏系列大秀上,品牌就邀请了插画师JamesJean进行二度合作,可见他作品的受瞩目程度。JamesJean与OliverSchrauwen作品此次,JamesJean与比利时涂鸦艺术家OliverSchrauwen联手创作了秀场空间的插画作品。观秀者望着这些画面感十足的作品,就像在看一页页现场版妙趣横生的连环画。与此同时,作者也为Prada专门制作了同样风格的插图版宣传视频。James这种酷劲十足的插画风格,与Prada未来感的时装风格相结合,显得相得益彰。JamesJean作品同年在Prada的女装秀上,品牌同样选择了与时尚插画师们联手。此次合作请来了八位女性插画师:StellarLeuna、TrinaRobbins、BrigidElva、JoelleJones、GiulianaMaldini、NatsumeOno、EmmaRíos和FionaStaples。她们除了共同打造了秀场空间内的墙壁作品外,还将插画作品完美融入了新一季的时装系列。他们的漫画风格作品给时尚注入活力的同时,也增加了时尚插画作品走向风格化的可能性。时至今日,时尚插画作品早已不再墨守成规,只要你愿意动笔,人人皆可创作出属于自己的插画作品。GraceCoddington作品先锋时尚插画除了与时尚品牌跨界合作外,还有一些职业时尚插画师坚持着进行独立创作。他们在掌握插画基本技法的同时,将时尚插画的绘画形式进行延展、探究,揣摩出了自成一派的风格。先锋时尚插画师VelwynYossy就描绘出了一系列别具一格的作品。从他作品中人物流畅、利落的线条,与夸张却依然恰到好处的整体比例中可看出,他一直奉行着现代主义的美学理念。VelwynYossy作品而另一新星时尚插画师ErnestoArtillo则将时尚插画延展至更为抽象的方向。他独树一帜的视觉表现手法打破了大众对时尚插画表现形式的传统认知。他近期一些超现实主义般的作品将动与静、虚与实的事物相结合,用手绘加拼贴的方式将插画的视觉冲击力无限放大,赋予了静态为主的时尚插画几分动势。ErnestoArtillo作品他的创意作品不仅仍然长期刊登在各大杂志上,而且还时常在世界各地展出。ErnestoArtillo说:“我希望看到自己的作品时感到既放松又激动。平时生活中也一样,我会寻找当中的平衡,也会找寻怎么可以打破现有的状态。”ErnestoArtillo作品纵使时尚插画的黄金时期已逝去,但不可否认的是,时尚插画依然在时尚领域占有一席之地,并同时饱含极高的艺术价值。时尚插画是少数可以将商业与艺术做到完美结合的行业,而当下受到追捧的插画作品的不断涌现,更是增添了时尚插画继续前行的可能。JamesJean动态时尚插画作品了解完这些最红、最引人注目的时尚插画作品,大家皆可提起笔去尝试发掘时尚插画新道路。下一个当红炸子鸡,也许就是你。精彩回顾:[编辑、文/陈卓]没有艺术细胞，如何给孩子进行艺术启蒙？超省钱的方法在这里毕加索曾说过:“我花了四年时间画得像拉斐尔一样,但用一生的时间,才能像孩子一样画画。”虽然每个孩子都是好的艺术家,作为没有艺术细胞的家长们,如何给孩子进行艺术启蒙?还没上学的娃娃们,是不是只能被送到画室里、早教机构了?其实不然,我们在家就能给孩子进行艺术启蒙,随处都是资源。跟着马里恩·杜查斯一起来看下,如何给孩子们进行艺术启蒙吧。马里恩·杜查斯是畅销书作家,她创作的《这不是一本艺术书》,是一本可以与孩子互动的游戏书。她毕业于英国伦敦皇家艺术学院,是一位在国际上享有盛名并屡屡获奖的插画师和童书作家。她的处女作《让我们创作伟大的艺术》畅销全球30万册,先后获得了全球年度创意与设计大奖“D&AD黄铅笔奖”插画设计奖金奖、英国插画界荣誉V&A博物馆插画奖等多个奖项。在《这不是一本艺术书》里,她将绘画、色彩、形状、颜料、纸张、印画和图案等7大主题艺术融入其中,家长们与孩子进行亲子游戏时,就可以进行艺术启蒙,是一本教给家长和孩子的艺术创作书。这本书是一本拿起来就能玩的游戏书,无论是大孩子还是小孩子,只要会握笔,就能玩得停不下来。因为涉及到7大主题,共有50个创意游戏,每个孩子总能找到创作的乐趣。游戏所需的工具可能只是一支铅笔,就可以绘制出3D幻视手,一笔不停地画出你想看到的画作。即使毫无章法,也可以作为艺术创作,叫做“乱涂乱画”。并不只是看到杂乱无章的线条,线条会有交叉,可以将交叉的地方涂上颜色,就可以成为一幅有趣的画作了。我记得小时候经常会将墨水滴到纸上,然后再吹,随意吹,当时还觉得自己吹得特别漂亮。在这本书里,竟然意外地见到了小时候玩的这款游戏,其实就叫“吹画”。玩法也是将墨水滴到纸上,可以用吸管、或者麦秆,甚至是直接用嘴吹,就可以吹出各种形状的动物、植物了。如果再涂上颜色,就是随你心意的任何事物。即使是只用废旧的报纸、一把剪刀、一根胶棒,也可以创作出“蒙太奇”这样高大上的作品。而书里还有一些作为家长,我也刚接触的留影盘、印画等创作形式。孩子们更是有无穷的想象力,可以将他们天马行空的想法,直接体现在纸张上。最初拿到这本书的时候,觉得只是7个主题下的游戏,仔细玩起来发现,这本书里是有逻辑存在的。正如中国美术学院原副院长宋建明所言,“全书似乎内容随意,轻松活泼,实则结构严谨,知识面广”。即使是最不起眼的铅笔画,最初是用简单的画笔,画出各种线,只要会拿笔了,孩子们总会画出各种各样的线,让他们知道到自己能做到。然后就会增加稍微复杂的项目,比如一笔画出一个图形,再复杂些,一笔画出自己设计的迷宫,如果将乱七八糟的铅笔画,给涂上颜色,说不定就成了特别有艺术感的画了。先是简单的一支铅笔,然后再增加颜色,涉及到颜料笔、调色板等,增加孩子们对色彩的认知。除了笔,还有报纸、大自然的树叶、甚至是一张彩色的纸,都能创作出无穷的艺术品。比如折出来的小猫咪,用剪刀剪出来的纸人、小树,剪纸这项中国传统的工艺,让孩子们在游戏中就接触到了。现在流行的蒙特梭利教育方式,除了让孩子以自我为中心外,还会涉及到数学的领域。在《这不是一本艺术书》中,也涵盖了数理部分的内容。在铅笔拓印这部分,就出现了按照数字连线,组成形状的游戏;还有根据点画出正方形、长方形、立体的正方体等。这本书将蒙托梭利的教育理念融会其中,以孩子为中心,让孩子勇于表达自我。每当谈到艺术的时候,我总是不得章法,不知道该如何给孩子讲解艺术。去看画展吧,我自己也只能说出“太漂亮了”“太艺术了”这样的词语,更别说怎么给孩子进行这方面的教育了。而《这不是一本艺术书》却这样教给我们家长,关于艺术启蒙,不要怕,随处都是素材。记得秋天的时候,有很多用银杏叶做成的花朵,用各色树叶拼成的艺术品,大自然是最好的艺术创造者。我们可以用树叶,与孩子一起印画,制作成漂亮的树叶画。另外,给孩子最好的启蒙方式,就是给他们好的引导。在《艺术游戏力》这本书中,就提到艺术是孩子们的一种表达方式。法国的孩子们在等餐时,总是会在餐巾纸上涂涂画画,他们无论地点、时间,总是用这种方式进行着自我沟通。而我们可以做的,就是给他们创造这样的环境,给他们一点提示,然后按照他们自己的想法进行创作。马里恩·杜查斯也有相同的观点,她在书里鼓励孩子用每种颜色画出图案,代表自己的感受。蓝色的圈是什么呢?是伤心吗?红色的曲线是什么呢?是开心了?引导着孩子们自己表达出他们的想法。这真的是一本将艺术启蒙搬回家的书,不仅孩子爱玩,增加与爸妈的亲子时光,作为成人,也可能会被激发出创作灵感。

爱自己也爱别人：骨髓移植的真实故事我的人生，不敢说向来一帆风顺、志得意满、所向无敌，但至少在各方面，也都游刃有馀。但就在四十二岁那年，遇到了前所未有家庭风暴、失业瓶颈、经济危机，我发现我整个人变了，不再踌躇满志、满腹理想、满腔热血、满脑计画，而是窝在家里，甚麼也不想，只想不再活在这世上。这时候，由於我是学护理背景的，所以惊觉到自己可能生病了，经过在精神科三个月的诊疗，确诊我得了重郁症，被发下了重大伤病卡。重郁症＋癌症，到底会如何？一段日子的按时吃药、回诊、心理治疗，我算稳定了，也工作了一段时间，但三年後，又由於工作压力，情绪重担，导致重郁症复发，甚至必须住院的地步。就在住院的时候，照X光发现，我的脊椎骨骨头有空洞，不知道是甚麼原因，但为免影响我情绪更为低落，只敢给我做一些简单的检查，并继续追踪。这段期间，在精神科住院进进出出，一直觉得全身痠痛，怕是因为已届中年、缺少运动、吃药影响等等原因，也就没有多在意。但逐渐地，我经常跌倒，背痛去复健治疗也不见好转，且更为严重，严重到必须坐轮椅，躺在床上翻身都会痛，而骨头空洞的地方经MRI追踪，有扩大的情形，就叫我一定要做骨髓切片，这非常痛还不是重点，内心的煎熬与恐惧才是无以形容，终於结果出来，我确定罹患了一种血液癌症，叫做「多发性骨髓瘤」，且我确诊时，已经侵蚀多处骨头，是这个癌症的第三期，也就是末期了。多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma）是一种血液中浆细胞不正常增生，导致免疫球蛋白大量增加，侵犯骨髓与骨质，产生溶骨性病变；并压制骨髓的正常造血功能，导致红血球、血白球、血小板都下降，临床上经常是由於骨折而被发现。这种病在血液癌症中排名第三，好发於六、七十岁以上，我算是这个病中最年轻的。癌症加身，重郁症反而康复！确定得了癌症後，我必须接受这个事实，也就是说，我可能真的要离开这个世界了，既然要离开这个世界，那麼工作好不好，爱人爱不爱，家庭乐不乐，都将与我无关了，我就要到主耶稣那裏，所以我应该跟主耶稣把关系打好。这样，很奇妙的，得了癌症的我重郁症非但没有更严重，反而变好了，因为这世界上的一切我不再担心、忧郁、恐惧，我即将到我喜乐的神、爱我的神那裏去了，这时我才真正经历甚麼叫交托，甚麼叫放下。人生终究会到有一天，你不得不放下。当你真实交托给神，真正放下的时候，一切问题就解决了。重郁症好了後，癌症怎麼治疗呢？经家人介绍我找到了荣总血液肿瘤科主任曾成槐教授当我的主治医师，曾教授说因为我还年轻，可以做骨髓移植，但甚麼叫骨髓移植呢？传统我们认为骨髓移植就是要跟别人配对，然後抽取别人的骨髓，经手术注入你的骨髓内。但事实上，目前的医学不是这样的，现在百分之九十五以上的造血干细胞移植，应该都不是叫做骨髓移植，而是周边血干细胞移植。现在的造血干细胞移植应为周边血干细胞移植首先，我们要知道甚麼是干细胞？就是一种具有自我更新、繁殖，并可分化成不同种类成熟细胞能力的一种母细胞。那麼甚麼是造血干细胞呢？就是可以分化成红血球、白血球、血小板的造血母细胞，通常都存在脐带血、骨髓，及周边血液中。我在经过标靶化疗後，症状改善已经可以走路了，再经过高剂量化疗，就要做自体周边血干细胞移植了。甚麼是自体周边血干细胞移植呢？人体周边血内本来就有造血干细胞，但是数量不足，所以当我在经过高剂量化疗彻底破坏我原先的造血系统後，必须再打入白血球生长激素，刺激骨髓内的造血干细胞大量跑到周边血液中，然後用像输血方式抽出的血液经分离技术，筛出干细胞，悬浮在血浆中，同时也把多馀的血液再输回体内，这样的过程总共大概要做十二小时，分成三天，每天上午四小时。抽完干细胞经评估後有足够量，就冷冻在负三十六度C储存槽中，待完成移植前超高剂量全身化学/放射治疗後，再把干细胞像输血的方式，打回我的体内。这就完成了所谓自体周边血干细胞移植。癌症复发，决定做异体周边血干细胞移植！移植後我还要继续吃药控制，这时候才知道原来这个病在十年前其实是无药可治的，但现在医学昌盛，这个病已逐渐成为慢性病，甚至可以治愈。当我正想我应该可以没有问题，成为一个正常人时，就在不到一年的时间，因为曾教授亲自给我做的骨髓切片追踪中，发现了几个芽细胞，就是不好的细胞冒出头来了，立刻通知我住院，宣布癌症复发，要商议治疗方法。我如同走在大楼街道中，正享受阳光与人群的喧闹欢乐时，却突然被一盆冷水从头顶浇了下来！主耶稣这次真的要把我从这世上带走吗？我不知道！只知道医生告诉我有一种新药，但新药的临床实验人数已满，我排第十一个，必须一个月自费三、四十万。我想我是没有钱的，这怎麼办？命是钱买来的吗？医生当然说不是，也经过我祷告寻求神，决定与其用新药做白老鼠，那就再做一次同样的标靶化疗吧！医生也说除此之外，还要再做一次自体移植，并做一次异体移植。甚麼是异体周边血干细胞移植呢？就是自体移植讲究的是自己的干细胞输给自己，但自己的干细胞里可能本来就有这种癌症基因，所以并不能够治愈，只能够延缓发病，因此自体移植後我一直还需要吃抗癌药物。但异体移植就不同了，这乃是健康成人的造血干细胞输入你体内，代替你原来所有的造血系统。真的没有人愿意捐造血干细胞给我吗？为避免芽细胞中星星之火燎原，医生即刻开始给我做治疗，这一次原预定标靶化疗後要再做一次自体干细胞移植，但是由於去年才抽过，所以抽出来的干细胞数量不足，不能做移植，我等於多做了一次高剂量化疗，杀得更乾净。接著只有赶快做异体移植，医生问我有没有兄弟姊妹可以捐干细胞给我，我说没有，那就需要找慈济骨髓资料库配对。那时候我想，是生是死都不重要，只要在永远里我的神心满意足最重要。经过一个月後，医生说异体造血干细胞移植捐者最好的状况，是要有六分之六与我相符，医生说已经找到了，预备要移植，但一周後，又说那一个人临时又不愿意捐了。我真不知道这是怎麼回事？谁愿意捐给我呢？医师说继续寻找配对。过了一个月後，又找到了，但是同样又临时不愿意捐了，我告诉自己，有不乐意的心的这个人，细胞也不一定是好的！第三次，又有配对到的，人家要配对符合的，已经不容易了，我配对到三次哩！可是，这一个人又不愿意捐了。到底为甚麼不愿意捐呢？我不知道，我想可能是让你抽个十西西血去配对很容易，但是要你住院全身健康检查，又要打白血球生长激素，躺在那裏慢慢像输血一样抽个三天干细胞，可能没人有这一周的空档吧！即使现在真的不用抽骨髓液要全身麻醉那麼危险又麻烦！但这真的还是需要有很大的爱的勇气。这期间，我一直相信，神要我活，我就会活，谁也无法阻止，神要我到他身边，我就会离世，谁也无法强留。所以，又一个月後，有第四个配对上了，但他只有六分之四跟我符合，可是他愿意捐给我，医生说可以做移植，我问六分之六跟六分之四会有甚麼差别呢？医生说只有排斥可能会比较大一点，我就放心地接受移植了。住进无菌室，发出病危通知！正收到这个好消息时，我坐我先生的摩托车，却不幸在十字路口整车摔倒，不能站起，小腿血流如注，即刻送急诊，我想这时如果骨折，就不能做异体移植了。但是，照了X光，我居然只是破皮，我这个病的患者不是几乎不碰撞都会骨折的吗？我居然车祸都没有骨折，我想这是神让我作异体移植的，所以那时候我很确定，我会活。做异体移植跟做自体移植不太一样，除了化疗剂量更高外，还要做全身放射性治疗，然後送进无菌加护病房。在无菌室里，许多跟我一样的病患，因为呕吐、溃疡等种种情形，痛苦的不想活，但只有我知道，我会活。进无菌室时，我那时将近一百公斤，进了无菌室，因为根本吃不下东西，只能靠打营养针，所以一天瘦一公斤。在无菌室时，医生发出病危通知，白血球降到零至五颗，但是我还是知道，守在病房玻璃窗外的丈夫，一定会接我回家的。在无菌室十七天後出来，问题接踵而来，我全身皮肤疼痛到要打吗啡，手脚起泡溃烂，然後全身像浴火凤凰一样换了层皮。这个现象经皮肤切片确定是移植引起的GVHD (Graft-versus-host disease)，这是一种移植物对抗宿主的疾病，产生的情形是由於捐赠者的T细胞攻击接受者器官组织，一般发生在皮肤、肝脏、肠胃，而我很幸运地只发生在皮肤，危险性也比较小。血型、DNA变换，成为健康人！医生告诉我，捐赠者细胞攻击我的器官，叫GVHD；我对抗外来的细胞，叫排斥现象。移植还引起了我另一种疾病，叫做「阻塞性小支气管炎」，被认为可能要经常用氧气。此外，感染也发生了，每天发烧，全身核子扫描都找不出感染原因，两个月後又莫名其妙的好了，且出院半年後，肺功能正常，也不必再用制氧机给我氧气。後来我才知道，原来异体移植存活率只有百分之三十到五十。现在，我已经移植後无病存活三十三个月，DNA变成捐赠者的，血型也从O型变为A型，再过三个月，就可以宣告完全治愈了。当然，我目前除了不太能运动外，可以完全正常上班生活。这一切经过，我除了感谢我的神，也感谢身旁爱我并我爱的人，因为有爱，所以我存在。当然，我不知道那位捐赠给我干细胞的是谁，只是现在的科技已经可以验出是位年轻男性，所以医生幽默的说我是双重人，中年女性身上有年轻男性的细胞。我真的必须谢谢这个人救了我一命，因为他无私的爱，叫我获得新生，让我重新拥有一个爱自己也懂得爱别人的生命。

肺泡上皮细胞。Cre就是一个重组酶,可以识别LoxP位点,其中脏脏cre表达在肺泡上皮细胞。皮细胞即皮肤细胞，是皮肤的浅层结构，由复层扁平上皮构成。

可以不买。死亡细胞soundtrack的音乐包可以在游戏外用播放器听里面的bgm，挺好听，山洞和观星台的bgm很推荐。不过反正也是网上找的到的东西除非为了支持作者并没有太大买的必要。《重生细胞》是一款RogueVania类型的平台动作游戏。你需要在一次一次战斗中锤炼战斗技巧，精通拥有独特使用方式的各种武器，并且将翻滚和闪避等走位操作视为本能，以逃过那些出其不意出现的怪潮侵袭，迎战强横凶残的守卫和Boss。

液基薄层细胞检测与以前的普通宫颈病理刮片是一个内容，以前的普通宫颈刮片已经被淘汰了，这个液基薄层细胞的正确率高，能有效的筛查宫颈癌前病变，做了这个液基薄层细胞检查，宫颈刮片的就不用做了

对于这样的科学计数法次方数就看E后面的即可而这里的1.15E+02E+02就是10的2次方即100实际上就得到115

试述什么是细胞化学染色，说明其基本步骤，并指出在细胞化学技术不是单一的技术，而是一整套有关联的技术，包括酶细胞化学技术，免疫细胞化学技术，放射自显影技术，示踪细胞化学技术等.

试题答案：D 试题解析：试题分析：脂肪：①细胞内良好的储能物质，②保温、缓冲和减压作用；A正确。染色体的主要成分是DNA和蛋白质；B正确。固醇包括胆固醇、性激素、维生素D；C正确。纤维素属于多糖，乳糖属于二糖；D错误。考点：细胞化学成分。点评：本题相对基础，注重学生的基本知识的过关。

1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS 或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。3. Schiff 反应：细胞中的醛基可使Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。4. 联苯胺反应：过氧化氢酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。6. Formazane 反应：显示脱氢酶。7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。9. 茚三酮反应：显示蛋白质。

看染色体数目，秋水仙素处理，醋酸洋红染色

蛋白质一般以糊粉粒的状态存在于细胞中，蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分。机体所有重要的组成部分都需要有蛋白质的参与。一般说，蛋白质约占人体全部质量的18%，最重要的还是其与生命现象有关。蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Aminoacid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

TSCM 细胞(T memory stem cell) T记忆干细胞 细胞 （英文名：cell）并没有统一的定义，比较普遍的提法是：细胞是生物体基本的结构和功能单位。已知除病毒之外的所有生物均由细胞所组成，

细胞器染色maker原理染料水溶液。根据查询相关信息得知，对DNA染色的细胞核染色剂，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染。

环境胁迫会导致生物体免疫功能下降，对病原的敏感性增加，免疫器官如头肾、脾等组织结构会发生变化（Ellsaesser and Clem，1986；Israeli and Kimmel，1998），免疫系统血液成分改变，包括白细胞(Leucocytopenia)、淋巴细胞(Limphopenia)和嗜中性粒细胞(Neutrophilia)的减少。经过18小时运输以后，体外培养免疫细胞功能分析发现，鱼体B细胞和T细胞丧失了对免疫原脂多糖（LPS）和伴刀豆蛋白（ConA）的反应，造成体液免疫功能大幅度下降（Ellsaesser and Clem，1986）。环境胁迫影响机体免疫功能，主要是通过肾上腺皮质激素的作用。血浆中的皮质醇激素对免疫系统有抑制作用，造成血液中淋巴细胞和嗜碱性白细胞的减少，引起淋巴器官的萎缩，抑制细胞免疫（林海，1997）。人体内的白血球是维生素C需求量最高的细胞，若供应不足则白细胞无法发挥免疫功能。在鱼类，维生素C对补体及血球凝集素有重要的影响，当鱼体受到病原感染时对维生素C的需求量增加；水中有病原体时，提高维生素C的供应量可以降低病原体感染的机会。

不会了啦

直接意思就是 微管结合蛋白

一、细胞及培养 1． Marc145细胞上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。 2． 生长培养基 DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋ ５％～10％新生牛血清+ 1％双抗（青霉素和链霉素）的培养液。 3． 冻存液 生长培养基＋10％ DMSO 4． 细胞健康生长的几项注意事项 1）细胞没有支原体等外源因子的感染。 2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。 3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。 4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。 5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。 6）细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。二、病毒感染、维持和收获 转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。 维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。 pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。 细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。 第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。 收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。三、细胞病变（CPE） 细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。图1是长成单层的marc 145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。图1 健康的Marc145细胞图2图3图4图2、图3和图4均是出现CPE的Marc 145细胞四、PRRS病毒在细胞中增殖规律（ Virology Journal, 2006, 3: 90） PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20－22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5％的细胞呈PRRSV阳性（PRRSV-positive）。第二阶段：感染后的2－3天（也称为病毒的对数感染期），病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出现了感染细胞群。 感染过程如图5所示。 对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。 图5 荧光抗体染色显微法观察PRRS病毒感染Marc 145细胞过程，A指PRRS病毒感染24hr，B和 C指PRRS病毒感染后42－46hr，D指PRRS病毒感染后72hr。

猴胚胎肾上皮细胞

按照目前更公认的说法,唯一具有全能性的细胞就是受精卵（topipotent）,其他的我们只能叫做多能干细胞（pluripotent）,专能干细胞（multipotent）和单能干细胞（unipotent）.而多能干细胞一般包括我们所说的胚胎干细胞与诱导性多能干细胞,这两种细胞在一般情况下看来是发育潜能相似的,都可以在四倍体补偿技术的条件下产生一个个体,在注射到裸鼠皮下或者肌肉内发育成三胚层组织.注意,胚胎干细胞与诱导性多能干细胞,都是自然条件下不存在的,是认为得到的.

HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（de novo pathway）和中间合成途径（salvage pa-thway）。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。 单克隆抗体技术中也要选择有用的杂种细胞（即能产生抗体，又能无限传代）

　　为什么HAT培养基可以把杂交瘤细胞选择出来　　HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（de novo pathway）和中间合成途径（salvage pa-thway）。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力而死亡。根据这一点，不仅把混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择，例如嘌呤的中间合成途径缺失株和嘧啶的中间合成途径缺失株，由于可以互补，所以两者的杂种细胞，即使在氨基蝶呤的存在条件下也可以增殖。在这种情况下，利用HAT培养基可对杂种细胞进行选择。次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。　　单克隆抗体技术中人工诱导小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合后，细胞将以多种形式出现，如脾细胞-瘤细胞、脾细胞-脾细胞、瘤细胞-瘤细胞、细胞多聚体、未融合的脾细胞和瘤细胞等，其中只有脾细胞-瘤细胞的融合体是有用的。正常的脾细胞在培养基中存活仅5-7天，无需特别筛选，细胞多聚体也容易死去，关键问题是要去除未融合的瘤细胞。选择培养基具有3种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨甲蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶核苷（thymidine），故名HAT培养基。这个培养基通过抑制瘤细胞的核苷酸合成，达到去除未融合瘤细胞的目的。细胞有两条基本途径合成嘌呤核苷酸，一条是从磷酸核糖、氨基酸、CO2和NH3等化合物开始，叶酸是重要的辅酶，而氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞通过这一途径合成核苷酸。另一条途径是利用已存在的碱基，经特异的磷酸核糖转移酶催化合成核苷酸，如次黄嘌呤经过次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）转变为嘌呤核苷酸。融合所用的瘤细胞是选择出来的HGPRT缺陷细胞株，因此不能在HAT培养基中生长，而且不合成或不分泌免疫球蛋白。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖并分泌抗体。杂交瘤细胞选择成功后，还需要将细胞稀释为单个培养，用ELISA法鉴定和选择高分泌特异抗体的杂交瘤克隆

fsc代表的是forward scatter，这个参数和细胞的大小成正比。A 是area的缩写，H是height的缩写。这是机器在记录信号时所采用的参数（不显示在用户界面，一般在调试机器的时候可以显示）每个细胞通过激光的时候，机器都会记录一个波状信号（一个拱形的信号），H就是这个拱的高度（代表的是信号的强度），A就是这个拱的曲线下面积，代表信号强度和细胞大小的关系。其实还应该有一个参数W，是width的缩写，是这个拱的宽度，代表细胞通过激光束所花的时间。不光是FSC，其他每一个通道都有这三个参数可以记录。然后可以用其中的任何一个，根据实验要求来作图。机器就会根据设置显示出最终的图形了。

巨噬细胞（Macrophages）能够吞没、破坏受损伤组织，有助于启动康复过程。虽然它们在损伤位点发挥关键作用，但一旦任务完成，就需要尽快撤离，结束炎症反应，为再生过程开路。继续存在的巨噬细胞不利于组织恢复。尽管研究人员对于启动巨噬细胞的分子机制研究的比较透彻，但关于其退出损伤位点的过程还了解甚少。研究人员鉴别出一清除外周神经损伤位点巨噬细胞的关键环节，对弄清脊髓损伤、中风和多发性硬化中相似的分子机制提供了重要线索。已知Nogo细胞受体家族与神经细胞生长有关，SamuelDavid等观测Nogo家族成员NgR1的作用。NgR1类受体是位于细胞膜上的蛋白开关，受到特异化学信号或配体刺激后，诱导细胞反应。 　　破坏大鼠、小鼠的大腿坐骨神经，观察NgR1在修复过程中的作用，结果发现巨噬细胞到达损伤位点后，细胞表面会表达NgR1。进一步研究发现，受损神经合成髓磷脂时，NgR1不仅阻止巨噬细胞与髓磷脂结合，而且直接排斥正在形成过程中的髓磷脂，若抑制髓磷脂再生，巨噬细胞会停留在损伤位点周围。最终，研究人员在髓磷脂上鉴别出特异激发排斥反应的分子。可应用于外周神经以外的神经（中枢神经），他们发现中风、多发性硬化和脊髓损伤过程中激活的巨噬细胞，表面都会表达NgR1。

过多脂肪酸会使巨噬细胞自噬减少从而向M1转化，反过来说，脂肪酸动员，食物减少会使巨噬细胞向M2分化

单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

多发性骨髓瘤细胞分泌的细胞因子，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

博凌科为生物科技-为你解答：1、欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 90 ％致密度。2、冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。3、注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4℃ 避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。4、冷冻保存之细胞浓度：（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma 会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。5、冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。6、冷冻方法：（1）传统方法: 4℃ 10 分钟--- -20℃ 30 分钟--- -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜)--- 液氮槽vapor phase 长期储存。（2）程序降温：利用等速降温机以1 ～ -3℃/分钟之速度由室温降至120℃，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。7、材料：（1）生长良好之培养细胞（2）新鲜培养基（3）DMSO (Sigma D-2650)（4）无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)（5）0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)（6）血球计数盘与盖玻片（7）等速降温机(KRYO 10 Series II)8、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。（5）冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃ 10 分钟 -20℃ 30 分钟 -80℃ 16～18 小时(或隔夜) 液氮槽vapor phase 长期储存。（6）冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL

多发性骨髓瘤细胞分泌的细胞因子，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。采用FCM免疫荧光技术可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的细胞因子，用两种不同的荧光素分别标记不同的抗体可在同一细胞内同时测定两种不同的细胞因子。甚至可利用多种参数流式细胞术对胞内多种细胞因子进行测定。

这几年单细胞实验和分析技术如雨后春笋般涌现，相关文章也层出不穷，各种软文也是铺天盖地。作者呕心沥血整理了一篇关于单细胞的长文，详细介绍单细胞转录组分析的整体分析。本文是第一篇，我们一起来看看单细胞转录组的基本知识。 单细胞转录组就是某一时刻单个细胞内所有mRNA总表达量，其表达量反映该细胞的总体特征。随着2009年汤富酬老师首先开发单细胞转录组技术后，单细胞转录组技术如雨后春笋般涌现出来，比如Smart-seq、CEL-Seq、Quartz-Seq、Drop-seq、InDrop-seq、Smart-seq2等等。单细胞转录组技术的出现使得我们可以把研究的精度从组织多细胞层面精确到单个细胞领域，可以单独研究某个细胞或者某群细胞具体的特征，特别是对于细胞发育、肿瘤微环境、单细胞图谱绘制方面发挥了关键作用。 单细胞转录组的平台有很多，常用的有10xGenomics、BD Rhapsody、Fluidigm C1、Bio-Rad等平台，其中10xGenomics单细胞转录平台由于其成本优势和通量优势，是最常见的一种单细胞解决方案提供商，其在市场上处于绝对优势。10xGenomics单细胞转录组平台能够一次高效地捕获100-80,000细胞（一个芯片），1000个细胞的双细胞率仅为0.9%，是目前最为常用的单细胞捕获平台。 在这里主要也是介绍基于10xGenomics单细胞转录组平台数据进行的后续生信分析以及注意事项。 普通转录组（Bulk RNA）是生物组织样品中在某个时间对应的所有mRNA转录情况，通常作为组织或者样品某个时刻状态的重要指标，不同的样品、不同组织、不同物种、不同的处理都会造成mRNA表达情况的改变，从而调控机体的生命状态或者执行某些细胞功能，相对于蛋白而言，mRNA的稳定性和检测的便利性，大大促进了转录组技术的发展和应用。 “Every cell is unique—it occupies an exclusive position in space, carries distinct errors in its copied genome and is subject to programmed and induced changes in gene expression. Yet most DNA and RNA sequencing is performed on tissue samples or cell populations, in which biological differences between cells can be obscured by averaging or mistaken for technical noise.” ----Method of the Year 2013(Nature Methods ) 但是样品或者组织的转录组是所有细胞的一个转录组表达量的平均值，不能反映样品中所有细胞或者某群细胞的状态，因此需要对单个细胞的或者某群细胞的转录状态进行深入的研究，这样将更精细、更准确反映组织的状态。 如果在进行免疫或者药物反应研究的时候，可以更精准地针对细胞或者细胞亚群进行免疫治疗或者靶向治疗，这是精准医疗必要条件。 在思考这个问题之前，我们首先需要考虑的是什么是单细胞转录组？只有了解单细胞转录组本质以后，才能更好了解如何去研究？ 10xGenomics单细胞转录组基本流程如下图所示，我们最终得到的是一个表达矩阵，此矩阵一般每行为基因，每列为细胞。其实这个矩阵就是每个细胞所有的基因表达情况。 后续10xGenomics单细胞转录组的分析几乎都是基于上述方式得到的表达矩阵进行分析的，不管是聚类还是发育轨迹构建，其实 单细胞转录组研究的本质就是研究我们捕获细胞的的异质性 ，也就是研究细胞与细胞具体有什么差异，研究样品中有什么类型的细胞，这些细胞有什么差异。 异质性具体如何研究？虽然现在单细胞转录组分析的工具和方案有几百种，就本质来说， 只有两种研究方法：一种是细胞类型的差异；另外一种是发育轨迹的构建。 现在所有的工具都可以归类到此两类。 单细胞转录组表达矩阵的获取 10xGenomics单细胞转录组表达矩阵一般是通过 cellranger 软件获取，cellranger为10xGenomics官方分析软件，一般后续高级分析或者重新分析都是基于此矩阵。 一般cellranger资源消耗如下图所示： 这一篇我们对基本知识进行了介绍，同时讲解了如何获得表达量矩阵。下一篇我们会介绍详细的单细胞转录组亚群分析过程和原理，请大家继续关注。 参考文献 1.Giovanni Iacono, Ramon Massoni-Badosa, Holger Heyn. Single-cell transcriptomics unveils gene regulatory network plasticity[J]. Genome biology, 2019, 20(1). 2.Gioele L M , Ruslan S , Amit Z , et al. RNA velocity of single cells[J]. Nature, 2018. 3.Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131. 4.Zhang X, Lan Y, Xu J, et al. CellMarker: a manually curated resource of cell markers in human and mouse[J]. Nucleic Acids Research, 2019. 5.Aran D, Looney A P, Liu L, et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage[J]. Nature Immunology, 2019, 20(2): 163-172. 6.Aibar S , González-Blas, Carmen Bravo, Moerman T , et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering[J]. Nature Methods, 2017. 7.Wouter, Saelens, Robrecht, et al. A comparison of single-cell trajectory inference methods[J]. Nature Biotechnology, 2019. 8.F, Alexander, Wolf, et al. PAGA: graph abstraction reconciles clustering with trajectory inference through a topology preserving map of single cells.[J]. Genome biology, 2019. 9.Diether L , Els W , Bram B , et al. Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment[J]. Nature Medicine, 2018. 10.Zheng C , Zheng L , Yoo J K , et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing[J]. Cell, 2017, 169(7):1342-1356.e16.

伪时间是衡量单个细胞在细胞分化等过程中取得了多大进展的指标。在许多生物学过程中，细胞并不是完全同步的。在细胞分化等过程的单细胞表达研究中，捕获的细胞在分化方面可能分布广泛。也就是说，在同一时间捕获的细胞群中，有些细胞可能已经很长时间了，而有些细胞甚至还没有开始这个过程。当您想要了解在细胞从一种状态转换到另一种状态时所发生的调节更改的顺序时，这种异步性会产生主要问题。跟踪同时捕获的细胞间的表达可以产生对基因动力学一个大致的认识，该基因表达的明显变异性将非常高。Monocle根据每个cell在学习轨迹上的进展对其进行排序，从而缓解了由于异步而产生的问题。Monocle不是跟踪表达式随时间变化的函数，而是跟踪沿轨迹变化的函数，我们称之为伪时间。伪时间是一个抽象的分化单位：它只是一个cell到轨迹起点的距离，沿着最短路径测量。轨迹的总长度是由细胞从起始状态移动到结束状态所经历的总转录变化量来定义的。 还是老规矩，跟着官网学习Monocle2的使用方法。官网如下： 单细胞基因表达研究使人们能够在复杂的生物过程和高度异质性的细胞群中描述转录调控。这些研究有助于发现识别特定亚型细胞的基因，或标记生物过程中的中间状态，以及在两种不同的细胞命运之间过渡态的基因。在许多单细胞研究中，单个细胞是以不同步的方式执行基因表达过程。实际上，每个细胞都是正在研究的转录过程中的一个瞬间。Monocle包是分析单细胞测序的工具。 Monocle引入了在伪时间(拟时间)内对单个细胞排序的策略，利用单个细胞的非同步进程，将它们置于与细胞分化等生物学过程相对应的轨迹上。****Monocle利用先进的机器学习技术(反向图嵌入)从单细胞数据中学习显式的主图来对细胞进行排序，这可以强大而准确地解决复杂的生物过程。 Monocle也可以进行聚类(即使用t-SNE和密度峰值聚类)。Monocle也可以进行差异基因表达测试，使人们能够识别在不同状态下差异表达的基因，沿着生物过程以及不同的细胞命运时基因表达的变化。Monocle是专为单细胞RNA-Seq研究设计的，但也可以用于其他分析。 Monocle 2包括新的和改进的算法，用于对细胞进行分类和计数，执行细胞亚群之间的差异表达分析，以及重建细胞轨迹。Monocle 2也被重新设计，可以很好地完成包含数万个或更多细胞的大型单细胞RNA-Seq数据分析。 Monocle perform three main types of analysis: 首先，Monocle 2使用一种简单的、无偏的和高度可扩展的统计程序来选择具有轨迹进展特征的基因。然后，它采用了一类流形学习算法，旨在在高维单细胞RNA-seq数据中嵌入一个主图。以前的方法是通过启发式分析细胞之间的成对距离来推断分支结构，而Monocle 2可以使用这张图来直接识别发育的命运决定。我们已经通过广泛的基准测试证明，Monocle 2优于其他工具，如Wishbone，而不需要用户指定轨迹的结构。 Monocle 2的算法是再2017年发表在nature methods 上，文章链接如下 文章中的核心理论为：每个细胞都可以表示为高维空间中的一个点，在高维空间中，每个维对应着一个有序基因的表达水平。高维数据首先通过几种降维方法，如PCA(默认)、扩散映射等，投射到低维空间。 Monocle 2然后在自动选择的一组数据质心上构造一棵生成树。 然后， 该算法将细胞移动到它们最近的树的顶点，更新顶点的位置以适应细胞，学习新的生成树，并迭代地继续这个过程，直到树和细胞的位置已经收敛。在这个过程中，Monocle 2保持了高维空间和低维空间之间的可逆映射，从而既学习了轨迹，又降低了数据的维数。****一旦Monocle 2学会了树，用户就会选择一个tip作为根。计算每个单元的伪时间作为其沿树到根的测地线距离，并根据主图自动分配其分枝。 因为monocle2学习树结构，与其他方法相比，分支结构自动出现。当它更新细胞位置并细化树时，monocle2简化了轨迹的结构，修剪了小的分支，这样最终的轨迹只保留了描述细胞状态显著差异的分支。 Monocle需要在R语言环境下运行。官网给出的都是R-3.4比较老的版本，现在都是R-3.6或者R-4.0以上版本。我们可以直接在Bioconductor中安装Monocle 2 。 查看系统中安装的这个包的版本文档 当然也可以在GitHub上安装最新版的Monocle2。 有时我们添加的特性需要你安装某些额外的软件包。当您尝试上面的命令时，可能会看到错误。您可以通过输入(例如)来在错误消息中安装包。 最后检查一下是否安装成功 方法一: 将Seurat object中数据提取来创建 FPKM/TPM值通常是对数正态分布的，而UMIs或读计数使用负二项更好地建模。要处理计数数据，请将负二项分布指定为newCellDataSet的expressionFamily参数： 稀疏矩阵用negbinomial.size()， FPKM值用tobit()， logFPKM值用gaussianff() 方法二: 直接读取表达矩阵来创建 方法三: 将Seurat对象直接转化为CellDataSet对象 如果我们想要从Seurat对象或SCESet中导入所有的插槽，我们可以设置参数"import_all"为TRUE。#(默认为FALSE或只保留最小数据集) size facotr帮助我们标准化细胞之间的mRNA的差异。 离散度值可以帮助我们进行后续的差异分析。 大多数单细胞工作流程至少会包含一些由死细胞或空孔组成的库。同样重要的是要删除doublets:由两个或多个细胞意外生成的库。这些细胞可以破坏下游步骤，如伪时间排序或聚类。要知道一个特定的基因有多少个表达，或者一个给定的细胞有多少个基因表达，通常是很方便的。Monocle提供了一个简单的函数来计算这些统计数据。 Monocle官网教程提供了4个分类方法： 1、Classifying cells by type Monocle提供了一个简单的系统，根据您选择的标记基因的表达来标记细胞。您只需提供一组函数，Monocle就可以使用这些函数对每个单元格进行注释。例如，您可以为几种单元格类型中的每种类型提供一个函数。这些函数接受每个单元格的表达式数据作为输入，并返回TRUE以告诉Monocle某个单元格满足函数定义的条件。所以你可以有一个功能，对表达成肌细胞特异性基因的细胞来说是真的，另一个功能对成纤维细胞特异性基因来说是真的，等等。 2、Clustering cells without marker genes Monocle提供了一种算法，可以用来计算“未知”单元格的类型。该算法在函数clusterCells中实现，根据全局表达式轮廓将单元格分组在一起。这样的话，如果你的细胞表达了许多特定于成肌细胞的基因，但恰好缺少MYF5，我们仍然可以识别它为成肌细胞。clusterCells可以在无监督的方式下使用，也可以在半监督的“”模式下使用，这允许使用一些专家知识来辅助算法。我们先来看看无监督模式。 第一步是决定哪些基因用于细胞聚类。我们可以使用所有的基因，但是我们会包含很多基因，这些基因的表达水平不足以提供有意义的信号。包括它们只会给系统增加噪音。我们可以根据平均表达水平筛选基因，我们还可以选择在细胞间异常可变的基因。这些基因往往对细胞状态有很高的信息量。 setOrderingFilter函数标记了在随后对clusterCells的调用中用于聚类的基因，尽管我们可以根据需要提供其他基因列表。plot_ordering_genes函数显示了基因表达的变异性（离散性）如何依赖于细胞间的平均表达。红线表示基于这种关系的单片体对色散的预期。我们标记用于聚类的基因显示为黑点，而其他基因显示为灰点。 Monocle使用t-SNE来给细胞聚类可视化 指定10个cluster 3、Clustering cells using marker genes 首先，我们将选择一组不同的基因用于细胞聚类。在我们挑选高表达和高度可变的基因之前。现在，我们将挑选与标记共变异的基因。从某种意义上说，我们将建立一个大的基因列表来作为标记，这样即使一个细胞没有MYF5，它也可以被其他基因识别为成肌细胞。 函数markerDiffTable接受CellDataSet和CellTypeHierarchy，并根据提供的函数将所有单元格分类为类型。然后在识别不同基因类型之间差异表达的基因之前，它去除了所有“未知”和“不明确”的功能。同样，您可以提供要从该测试中排除的影响的剩余模型。然后函数返回一个测试结果的数据帧，您可以使用它来选择要用于聚类的基因。通常情况下，最好挑选最适合每种细胞类型的前10或20个基因。这确保了聚类基因不受一种细胞类型标记的支配。如果可能的话，通常需要为每种类型创建一个平衡的标记面板。Monocle提供了一个方便的功能，可以根据基因在每种类型中的表达受限程度来对基因进行排序。 4、Imputing cell type 注意，我们已经减少了成肌细胞群中“污染”成纤维细胞的数量，反之亦然。但是“未知”细胞呢？如果为clusterCells提供CellTypeHierarcy，Monocle将使用它对整个簇进行分类，而不仅仅是单个细胞。基本上，clusterCells的工作原理与以前完全相同，只是在构建集群之后，它会统计每个集群中每种细胞类型的频率。当一个簇由超过一定百分比（在本例中为10%）的特定类型组成时，簇中的所有单元格都被设置为该类型。如果一个集群由多个单元类型组成，则整个集群都被标记为“不明确”。如果没有高于阈值的单元类型，则集群被标记为“未知”。因此，Monocle可以帮助您在缺少标记数据的情况下估算每个细胞的类型。 在发育过程中，为了对刺激做出反应，在整个生命周期中，细胞从一种功能“状态”过渡到另一种功能“状态”。处于不同状态的细胞表达不同的基因，产生蛋白质和代谢物的动态重复，从而完成它们的工作。当细胞在不同的状态间移动时，会经历一个转录重组的过程，一些基因被沉默，而另一些则被激活。这些瞬态通常很难描述，因为在更稳定的端点状态之间净化细胞可能很困难或不可能。单细胞RNA-Seq可以让你看到这些状态而不需要纯化。然而，要做到这一点，我们必须确定每个细胞的可能状态范围。 Monocle介绍了利用RNA-Seq进行单细胞轨迹分析的策略。Monocle不是通过实验将细胞净化成离散状态，而是使用一种算法来学习每个细胞作为动态生物过程的一部分必须经历的基因表达变化序列。一旦掌握了基因表达变化的整体“轨迹”，Monocle就可以将每个细胞放置在轨迹中的适当位置。然后，你可以使用Monocle的差异分析工具来寻找在轨迹过程中受调控的基因，如“寻找随假时间变化的基因”一节所述。如果这个过程有多个结果，Monocle将重建一个“分支”轨迹。这些分支与细胞的“决定”相对应，Monocle提供了强有力的工具来识别受它们影响并参与制造它们的基因。在“分析单细胞轨迹中的分支”部分中，可以看到如何分析分支。Monocle依靠一种称为反向图嵌入的机器学习技术来构造单细胞轨迹. Step 1: 选择定义过程的基因 推断单细胞轨迹是一个机器学习问题。第一步是选择Monocle将用作机器学习方法输入的基因。这叫做特征选择，它对轨迹的形状有很大的影响。在单细胞RNA-Seq中，低水平表达的基因通常非常嘈杂，但有些基因包含有关细胞状态的重要信息。单核细胞通过检测这些基因在细胞群体中的表达模式来对细胞进行排序。Monocle寻找以“有趣的”（即不只是嘈杂的）方式变化的基因，并用它们来构造数据。Monocle为您提供了多种工具来选择基因，这些基因将产生一个健壮、准确和具有生物学意义的轨迹。你可以使用这些工具来执行一个完全“无监督”的分析，在这个分析中，Monocle不知道你认为哪个基因是重要的。或者，你可以利用marker gene知识来定义生物学进展，从而形成Monocle的轨迹。我们认为这种模式是“半监督”的分析。 Monocle官网教程提供了4个选择方法： 前三种都是无监督分析方法，细胞发育轨迹生成完全不受人工干预；最后一种是半监督分析方法，可以使用先验知识辅助分析。 理想情况下，我们希望尽可能少地使用正在研究的系统生物学的先验知识。我们希望从数据中发现重要的排序基因，而不是依赖于文献和教科书，因为这可能会在排序中引入偏见。我们将从一种更简单的方法开始，但是我们通常推荐一种更复杂的方法，称为“dpFeature”。 Step 2: 降维 下一步，我们将把空间缩小到一个二维空间，当Monocle对细胞进行排序时，我们将能够很容易地可视化和解释这些空间。 Step 3: 按照轨迹排序细胞 如果你的树上有一堆状态，那就很难弄清楚每个状态都落在树上的什么地方了。有时，可以方便地“分面”轨迹图，以便更容易地查看每个状态的位置. 如果你没有时间序列，你可能需要利用你对系统的生物学知识，根据特定标记基因的表达位置来设置根。例如，在这个实验中，一个高度增殖的祖细胞群正在产生两种类型的有丝分裂后细胞。因此，根部应该有表达高水平增殖标记的细胞。我们可以使用抖动图来判断哪种状态对应于快速扩散： 官方给出的差异分析有三大方法，我们重点关注第三个：****根据伪时间功能寻找差异基因 1、Basic Differential Analysis 2、Finding Genes that Distinguish Cell Type or State 3、Finding Genes that Change as a Function of Pseudotime Monocle的主要工作是通过生物过程（如细胞分化）将细胞按顺序排列，而不知道要提前查看哪些基因。一旦这样做了，你就可以分析细胞，找到随着细胞进展而变化的基因。例如，你可以发现随着细胞“成熟”而显著上调的基因。让我们来看看一组对肌肉生成很重要的基因： 这个sm.ns函数指出Monocle应该通过表达式值拟合自然样条曲线，以帮助它将表达式的变化描述为进程的函数。让我们加入基因注释，这样就很容易看出哪些基因是重要的。 ** 研究时间序列基因表达研究时出现的一个常见问题是：“哪些基因遵循相似的动力学趋势”？Monocle可以通过对具有相似趋势的基因进行分组来帮助你回答这个问题，所以你可以分析这些基因组，看看它们有什么共同点。Monocle提供了一种方便的方法来可视化所有假时间依赖性基因。函数plot_pseudotime_heatmap采用CellDataSet对象（通常只包含重要基因的子集），并生成平滑的表达曲线，非常类似于plot_genes_in_pseudotime。然后，它对这些基因进行聚类，并使用pheatmap软件包进行绘图。这让你可以想象出基因模块在不同的时间内共同变化。** 通常，单细胞轨迹包括分支。这些分支的产生是因为细胞执行不同的基因表达程序。在发育过程中，当细胞做出命运选择时，分支出现在轨迹中：一个发育谱系沿着一条路径前进，而另一个谱系产生第二条路径。Monocle包含分析这些分支事件的广泛功能。 以Steve Quake"s的实验室进行的实验为例，Barbara Treutlein团队从发育中的小鼠肺中捕获了细胞。他们在发育早期捕获细胞，后来当肺中同时含有两种主要类型的上皮细胞（AT1和AT2）时，细胞就要决定变成AT1或AT2。Monocle可以将这个过程重构为一个分支轨迹，允许您对决策点进行非常详细的分析。下图显示了使用部分数据重建的Monocle轨迹。有一个分支，标记为“1”。当细胞从树的左上角经过树枝的早期发育阶段时，哪些基因会发生变化？哪些基因在分枝间有差异表达？为了回答这个问题，Monocle为您提供了一个特殊的统计测试：分支表达式分析建模，或BEAM。BEAM(Branched expression analysis modeling)是一种统计方法，用于寻找以依赖于分支的方式调控的基因。 BEAM进行统计分析 该热图显示的是同一时间点两个谱系的变化。热图的列是伪时间的点，行是基因。从热图中间往右读，是伪时间的一个谱系；往左是另一个谱系。基因是被按照等级聚类的，所以你看到的基因表达模式和谱系的表达模式是非常相似的。 We can plot a couple of these genes, such as Pdpn and Sftpb (both known markers of fate in this system), using the plot_genes_branched_pseudotime function, which works a lot like the plot_genes_in_pseudotime function, except it shows two kinetic trends, one for each lineage, instead of one. 相关资料： 官网 monocle2 拟时间分支点分析结果解读 单细胞分析实录(15): 基于monocle2的拟时序分析 Monocle2包学习笔记（四）：Differential Expression Analysis

都有

scater使用 calculateQCMetrics 函数计算QC metrics，它可以对细胞和基因进行一系列的数据质量控制，其结果分别存储在colData和rowData中。默认情况下，calculateQCMetrics函数使用原始的count值计算这些QC metrics，也可以通过exprs_values参数进行修改。 当然，我们也可以设置一些参照（如ERCC spike-in，线粒体基因，死亡的细胞等），计算其相应的QC metrics进行质量控制。 使用 plotHighestExprs 函数可视化那些高表达基因（默认查看50个基因）的表达情况。下图中行表示每个基因，橙色的线(bar)代表该基因在每一个细胞中的表达量，圆圈代表这个基因在所有细胞中表达量的中位数。默认情况下，使用基因的count值计算表达情况，也可以使用exprs_values参数进行修改。 使用 plotExprsFreqVsMean 函数进行可视化 上图趋势中的异常值可能需要进一步的调查。例如，高表达基因的pseudo-genes的比对错误将导致均值低的基因在所有的细胞中表达。相反，PCR的扩增偏差（或稀有种群的存在）可能会导致在极少数细胞中表达具有很高均值的基因。 对于细胞水平上的质控，我们可以查看参照基因（feature controls）的表达量比上总基因表达量的百分比，如果一个基因在总基因表达量上的比例多，而在参照基因（如ERCC）里少，就是正常的细胞，反之则不正常。 plotScater 函数会从表达量最高的基因（默认为500个）中选一部分，然后从高到低累加，看看它们对每个细胞文库的贡献值大小。这种类型的图类似于对芯片数据或bulk RNA-seq数据中按样本绘制箱线图可视化不同样本的表达分布差异。累积表达图更适用于单细胞数据，因为单细胞数据难以一次性查看所有细胞的表达分布的箱形图。 为了查看不同细胞的表达分布差异，我们可以利用colData中的变量将细胞进行分类。默认使用counts值进行绘图，我们也可以通过exprs_values参数指定其他的数据。 For plate-based experiments, it is useful to see how expression or factors vary with the position of cell on the plate. This can be visualized using the plotPlatePosition function: 可以使用 plotFeatureData 函数轻松地查看任意两个元数据变量之间的关系： The multiplot function also allows multiple plots to be generated on the same page, as demonstrated below. This is especially useful for side-by-side comparisons between control sets, as demonstrated below for the plot of highest-expressing features. A plot for non-control cells is shown on the left while the plot for the controls is shown on the right. 直接通过列数选取想要的细胞 使用 filter 函数根据指定条件选取想要的细胞 根据QC metrics设定阈值筛选高质量的细胞，这里我们选取那些总counts数大于100,000，表达的基因数大于500的细胞。 我们还可以通过 isOutlier 函数计算筛选的阈值，它将阈值定义为距离中位数一定数量的“中位数绝对偏差（MAD）”。超出此阈值的值被认为是异常值，可以假定它们是一些低质量的细胞，而将其过滤掉。这里我们选取那些log(total counts)值小于3倍MAD值的细胞作为outliers。 直接通过基因的表达量过滤掉那些低表达的基因，这里我们选取那些至少在4个细胞中表达的基因。 当然，我们也可以通过一些其他的条件（如核糖体蛋白基因，线粒体基因等）进行基因的过滤。 我们可以使用 plotExplanatoryVariables 函数查看不同解释因素的相对重要性。当对每个基因的不同因子进行表达量的线性回归模型拟合时，我们会对colData（example_sce）中的每个因子计算其对应的R2值。最好在表达量的对数值上执行此操作，以减少平均值对方差的影响。因此，我们首先对基因的表达量进行归一化处理。 上图中每条线对应一个因子，代表所有基因中R2值的分布。当然，我们也可以通过variables参数选择特定的因子进行计算可视化。 在这个小数据集中，total_counts和total_features_by_counts解释了基因表达中很大一部分的方差，它们在真实数据集中能解释的方差比例应该小得多（例如1-5％）。 缩放归一化（Scaling normalization）可以消除细胞特异性偏差，其使特定细胞中所有基因的表达增加或减少，例如测序的覆盖率或捕获效率。 进行缩放归一化的最简便方法是根据所有细胞的缩放文库大小定义size factors，使得平均size factor等于1，确保归一化后的值与原始count值的范围相同。 然后再使用 normalize 函数计算log转换后的归一化值，并将其存储在“logcounts” Assay中 虽然这种归一化的方式很简单，但细胞文库大小归一化并不能解决高通量测序数据中经常出现的成分偏差，它也不能解释影响spike-in转录本产生的差异。我们强烈建议使用来自scran包的 computeSumFactors 和 computeSpikeFactors 函数来进行计算。 批次效应的校正可以解决不同批次中细胞之间表达的系统差异，与比例偏差不同，这些偏差通常在给定批次的所有细胞中都是恒定的，但对于每个基因而言都是不同的。 我们可以使用limma软件包中的 removeBatchEffect 函数来消除批次效应。

质谱流式细胞技术（mass cytometry，MC）就是将电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）应用到单个细胞的分析，原理是用纯化的单元素同位素标记抗体，然后使用ICP-MS检测该元素离子峰。该技术融合了流式细胞分选仪和ICP-MS。操作流程简单，如图1所示，首先细胞用带有金属元素（一般是镧系金属）的特异性抗体标记3-4，然后被送入质谱流式细胞仪，细胞以单个细胞液滴状态被雾化后进入高温等离子体，产生自由原子，四级杆选择只通过镧系金属质量范围内的离子，去除其余离子，利用飞行时间质谱（TOF mass spectrometry）检测镧系金属离子的相对信号强度。质谱流式细胞仪由多伦多大学的研究人员首先研发出来，第一台商品化的质谱流式细胞仪名为Cytometry by Time-Of-Flight (CyTOF)，相关抗体试剂由DVS Sciences公司生产和销售。 传统流式细胞术用荧光基团作为报告分子，通过对发射光强度定量以确定目标分子的表达量，但荧光基团发射谱常有重合，尤其是在同一个实验中进行多参数测量的情况下，难以区分多个荧光基团。质谱流式细胞技术使用单一分子量的稳定镧系金属代替荧光基团作为报告分子，元素质谱分析仪能够通过分子量准确区分不同原子质量，并且不同镧系金属质量没有信号重叠，增加了定量的准确性。 [图片上传失败...(image-aa80a1-1648880444550)] 目前，质谱流式细胞技术可以同时对51个靶蛋白进行检测，每秒检测1000个细胞，平均每天可检测100个样品，最低检测限为100个拷贝分子，已经过验证的镧系金属标记抗体种类超过400种；除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰1，蛋白降解产物5，检测细胞存活率，细胞大小，mRNA转录子表达量6，DNA合成速率7以及蛋白酶活性8等的测定。 正如蛋白质组学中的非标记定量，质谱流式细胞技术对靶点的定量准确性也受到不同仪器离子化效率的差异、仪器状态等的影响；同时，传统的质谱流式细胞技术每次只能检测一个样品，通量较低。因此， 质量标签细胞条码技术（mass-tag cellular barcoding，MCB） 应运而生。 细胞经过药物等处理后，用多聚甲醛固定后，使用MCB试剂对不同样本的细胞进行条形码标记，然后将不同样本混合后进行常规质谱流式细胞分析前处理和检测。最终通过检测条形码对应的元素离子，对细胞进行样品归类。 [图片上传失败...(image-d344c1-1648880444550)] 图2. 多路质谱流式细胞技术 多路质谱流式细胞技术实验步骤如图2所示，不同处理的样本经过甲醛固定，使用不同mDOTA分子对不同样本进行标记，然后进行常规的质谱流式细胞分析的前处理和检测。 这里使用的mDOTA分子是一个双功能化合物，一端可以螯合金属离子，一端则可以和细胞中蛋白上的自由巯基以共价键形式结合（如图3所示），一个mDOTA分子可以螯合一个镧系金属元素原子，那为什么叫barcode呢？ Barcode 就是指可以同时添加多种被镧系金属元素螯合的mDOTA分子，在CyTOF中共价键被打碎后，每种镧系金属元素的峰即可形成有和无两种情况，使用的镧系金属元素螯合的mDOTA试剂的种类越多，最终可组成的条形码种类越多，如图4所示，使用7种镧系金属元素螯合mDOTA试剂，可以组成2的7次方种条形码，即可以同时标记128个样品。 MCB的使用，可以对多个样本同时进行单细胞定量分析，增加了质谱流式细胞分析技术的分析通量，并且增加了相对定量的准确性。 本文一开始提到的那篇Cell Stem Cell的文章，就是利用MCB技术，在单细胞层面研究人源红细胞生成过程中内源转录因子的表达和调控。 [图片上传失败...(image-bfca65-1648880444550)] 图3. mDOTA分子反应原理 细胞使用双功能分子mDOTA（maleimido-mono-amide- DOTA）以共价键形式进行标记。mDOTA一端可以螯合稀土元素，一端可以和细胞内的蛋白的巯基反应。 但是MCB存在一定的缺陷，首先在每次仪器校正后，质谱流式细胞仪的离子检测灵敏度都会发生变化，尽管可以用内参进行校正，将样品混合后检测会降低样品之间的变化程度； 其次，MCB使用镧系金属元素和后期使用的抗体耦连的镧系金属不能相同，因此MCB的使用缩小了后续标记抗体的选择范围。 因此，后来基于钯元素的MCB试剂被进一步发展出来11。 使用钯元素的6个同位素原子进行MCB分子的构建有以下两点优势： 首先，钯元素因为和标记抗体的试剂（Diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA)-based polymer）不兼容，抗体标记不会使用钯元素，因此MCB分子使用钯元素不会干扰后续标记抗体的选择； 第二，Pd有6个稳定同位素，102, 104, 105, 106, 108和110 amu, 纯度很高，分别为91%, 96%, 98%, 99%, 99%和99%，这些同位素和其他镧系金属元素质量相差甚远，不会影响后续的抗体耦连的镧系金属元素的检测。 [图片上传失败...(image-ed6df2-1648880444550)] 图4. MCB形成原理 使用七种镧系金属元素螯合mDOTA试剂，按图中分布添加mDOTA试剂，可以组成2的7次方种条形码，即可以同时标记128个样品。 最后我们简单说一下这个技术的优缺点。优点是可同时检测的通道比较多，现在可以做到同时检测51个目标蛋白；可操作性强，试剂都是商品化的；速度虽然比不上流式细胞仪（每秒10000个细胞），但也并不慢，每秒可检测1000个细胞；成本低，平均每个细胞测量成本仅需0.005美分，对比单细胞测序技术每个细胞平均22美元，可以说是相当便宜了。 当然，就目前来看，这个技术还存在不少的不足之处。 首先，细胞在分析中被雾化并离子化，在分析后不能保留完整的活细胞状态； 其次，灵敏度低于荧光基团，不能检测极低水平表达的分子，检测的动态范围最多只能达到3-4倍，而荧光基团的检测范围则可到50倍左右；第三，不同仪器之间的离子化效率不同，需要通过掺入聚苯乙烯珠子进行信号强度的校正，实现同一个仪器的数据的比较； 第四，和基于荧光基团的流式细胞技术一样，质谱流式细胞技术仍然不能检测小分子代谢产物，并且不能对一个细胞进行连续的动态监测； 最后，也是最重要的一点，不能对蛋白组中的所有蛋白进行监测，只能对特定目标蛋白进行检测，因此需要更为严谨的实验设计。 不管怎样，质谱流式细胞技术还在不断地发展和改进，我们能利用这个技术解决的问题也越来越多。希望通过这次对质谱流式细胞技术的系统性介绍，也能为大家目前面临的问题提供一点新思路，为大家的课题添砖加瓦。（来源清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质化学与组学平台） 参考文献： 1. Bendall, S. C.; Nolan, G. P.; Roederer, M.; Chattopadhyay, P. K., A deep profiler"s guide to cytometry. Trends Immunol 2012, 33 (7), 323-32. 2. Thomas, R., Practical Guide to ICP-MS: A Tutorial for Beginners, Second Edition. Pract Spectrosc 2008, 1-339. 3. Lou, X. D.; Zhang, G. H.; Herrera, I.; Kinach, R.; Ornatsky, O.; Baranov, V.; Nitz, M.; Winnik, M. A., Polymer-based elemental tags for sensitive Bioassays. Angew Chem Int Edit 2007, 46 (32), 6111-6114. 4. Majonis, D.; Herrera, I.; Ornatsky, O.; Schulze, M.; Lou, X. D.; Soleimani, M.; Nitz, M.; Winnik, M. A., Synthesis of a Functional Metal-Chelating Polymer and Steps toward Quantitative Mass Cytometry Bioassays. Anal Chem 2010, 82 (21), 8961-8969. 5. Bjornson, Z. B.; Nolan, G. P.; Fantl, W. J., Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Curr Opin Immunol 2013, 25 (4), 484-494. 6. Frei, A. P.; Bava, F. A.; Zunder, E. R.; Hsieh, E. W. Y.; Chen, S. Y.; Nolan, G. P.; Gherardini, P. F., Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods 2016, 13 (3), 269-+. 7. Behbehani, G. K.; Bendall, S. C.; Clutter, M. R.; Fantl, W. J.; Nolan, G. P., Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytom Part A 2012, 81a (7), 552-566. 8. Edgar, L. J.; Vellanki, R. N.; Halupa, A.; Hedley, D.; Wouters, B. G.; Nitz, M., Identification of Hypoxic Cells Using an Organotellurium Tag Compatible with Mass Cytometry. Angew Chem Int Edit 2014, 53 (43), 11473-11477. 9. Spitzer, M. H.; Nolan, G. P., Mass Cytometry: Single Cells, Many Features. Cell 2016, 165 (4), 780-791. 10. Bodenmiller, B.; Zunder, E. R.; Finck, R.; Chen, T. J.; Savig, E. S.; Bruggner, R. V.; Simonds, E. F.; Bendall, S. C.; Sachs, K.; Krutzik, P. O.; Nolan, G. P., Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat Biotechnol 2012, 30 (9), 858-U89. 11. Zunder, E. R.; Finck, R.; Behbehani, G. K.; Amir, E. D.; Krishnaswamy, S.; Gonzalez, V. D.; Lorang, C. G.; Bjornson, Z.; Spitzer, M. H.; Bodenmiller, B.; Fantl, W. J.; Pe"er, D.; Nolan, G. P., Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc 2015, 10 (2), 316-333.

做western blot需要多少细胞并不是一个固定的值这主要取决于蛋白的表达量，没有一个绝对的量如果做细胞总蛋白的话，至少10的4次方细胞每微升蛋白裂解液。一般可以每泳道取10的5次方细胞每微升蛋白裂解液（即10微升上样）根据这个数量级，结合western blot结果进行调整即可确认做western blot需要多少细胞

细胞分裂现在很难找了，PSP就出了一部本质，下载的话去http://lib.verycd.com/2005/08/02/0000059087.html找找，在eMule资源下面有，现在不知道有没有了，别的地方是没有了，我找过好长时间

楼上就能用啊嘿嘿！！谢谢楼上了！！！

mIgM、mIgD。膜免疫球蛋白（mIg）又称为BCR，表达于所有成熟的B细胞表面，是B细胞最具特性的表面标志，mIg的主要作用是结合特异性抗原，成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD。

如果我没算错,答案应该是0.014 有道公式：Ret%=(大方格内Ret／小方格内RBC＊9）＊100%

肿瘤细胞

ATCC上面写的是RPMI-1640+10%FBS

是不是在做药物处理的实验？vehicle一般是溶媒对照组，比如你的药物是用DMSO溶解的，那么vehicle组就是加入相同浓度的DMSO但不含你的药物，有时也用contorl表示，相当于阴性对照mock一般为什么也不加的空白组，有时也用blank，相当于空白对照mimic为模拟某个功能的组，相当于阳性对照

你好！就是肝细胞癌。前面只是特征。治疗方法很多，但效果都不太好!临床表现也很多。中体来说，目前没有啥很好治疗办法。

1) PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测：PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。美国著名生物试剂公司CLONTECH和Invitrogen公司分别开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。2)细胞内氧化还原状态改变的检测：这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM GlutathioneDetection Kit通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。正常状态下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。3)细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1 （apoptoticprotease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。4) 线粒体膜电位变化的检测：在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：1) TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3"-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。2) LM-PCR Ladder （连接介导的PCR检测）当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR），连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。3) Telemerase Detection （端粒酶检测）这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1．光学显微镜和倒置显微镜1． 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。2． 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2．荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3．透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维护正常组织和器官的细胞恒定与生长平衡，乃至机体衰老方面都起着重要作用。因此，有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展,凋亡细胞的检测方法显得非常重要。流式细胞仪( Flow cytometry ,FCM) 将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集于一体,较其它方法有不可比拟的优越性，既可定性又可定量,且具有简单、快速和敏感性高的特点,可进行多参数和活体细胞分析。在APO 的研究得到较为广泛的应用，开辟了新途径。1 光散射法在FCM 系统中，被检细胞在液流中通过仪器测量区时,经激光照射,细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线,其中前向散射光( FSC) 的强度与细胞大小有关,而侧向散射光(SSC) 的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,核碎裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞FSC 降低而SSC 增高。细胞坏死由于胞体肿胀,细胞核亦碎裂分解故FSC 和SCC 均增高。正常细胞FSC 高而SSC 低。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞表面免疫荧光分析结合起来,用以区别辩认经这些特殊处理发生选择凋亡的淋巴细胞亚型,也可用于活细胞分类。值得注意的是,根据FSC 和SSC 判断凋亡细胞的可靠性受被测细胞形态上的均一性和核细胞浆比率影响很大,因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好而在肿瘤细胞凋亡中其可靠性较差。2 　细胞DNA 含量的测定细胞凋亡时,核酸内切酶激活,导致DNA 断裂,这是凋亡的特征性表现,也为FCM 鉴别凋亡细胞奠定了基础。而检测细胞凋亡DNA 断裂的方法中,最常用、最简便的就是细胞DNA 含量分析。当细胞用乙醇、TrtionX—100 处理后细胞膜上出现漏洞,小片段DNA 从细胞内释放出来,使其DNA 含量低于正常细胞的二倍体。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍体C0/ G1 ,峰前出现“亚二倍体”峰,即细胞凋亡峰(APO峰) ,根据APO 峰可测出凋亡细胞百分率,该法简单易行,可大批定量检测凋亡标本,亦可同时分析细胞的细胞周期位置。另外,应用FCM 方法通过对DNA 和RNA 的联合检测可以鉴别出G0 期细胞,因此,可分析细胞凋亡与G1 或G0 细胸的关系。DNA 降解的程度取决于凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因子的特性。染色过程中DNA 的逸出量变化也影响FCM 检测结果。据研究,将高浓度的磷酸盐———枸椽酸盐缓冲液加入漂洗液中,可增高降解DNA 的逸出量,从而提高鉴别凋亡细胞与正常细胞的能力。DNA 含量测定在检测细胞凋亡中的局限性在于其特异性和敏感性均不高。特异性不高是因为APO 峰代表了一组细胞群体,包括凋亡细胞、机械损伤细胞、低DNA 含量的细胞或不同染色体结构的细胞,在上述情况下,DNA 与荧光染料的结合量均小。另外,非固定的细胞在低渗溶液中被溶解时,可导致大量的核碎片出现,此时APO 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目,并不代表凋亡细胞数目。敏感性较差的原因是细胞凋亡早期只有DNA 断裂点出现,但尚未出现DNA 片段的大量丢失,所以该法不能检出早期凋亡细胞和发生于S 期或G2/ M 期的凋亡细胞,因为其实际含量不低于二倍体细胞所含的DNA ,因此该法进行凋亡细胞分析时应结合其它形态或生化方法,以期更准确地分析细胞的凋亡状态。3 　Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)AO 可将细胞或细胞核中的双链DNA 和变性DNA 染成不同颜色的荧光。AO 插入双链DNA 中时,发绿色荧光;AO也可与单链或通过变性而产生的DNA 单链发生作用,这时发出红色荧光,因此,通过FCM 检测不同的荧光,可判断凋亡的发生。在测定被标准化后,绿色和红色荧光强度的量与总DNA 含量成比例,红色荧光与总体细胞(红色加绿色) 荧光的比率表示细胞中变性DNA 的比例,因此,这种方法可用于评价DNA 对原位变性的敏感性。有时候,凋亡细胞DNA 降解不明显,依赖于DNA 降解来检测细胞凋亡的方法如细胞DNA含量测定、DNA 末端标记等就难以检测到细胞凋亡变化。AO法检测凋亡的原理不依赖于DNA 片断的产生,因此其最主要的优点是可应用于寡核小体片段与凋亡不相平衡等情况,但AO 染色法不能有效区分有丝分裂细胞和凋亡细胞。4 　若丹明( Rh123) 染色法细胞生活状态下,胞膜上的钠- 钾泵、钙泵等的作用,使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成细胞膜电位。FCM 可以检测亲脂性离子荧光染料在胞膜内外的分布,来测量膜电位的高低,以评价细胞的活力。Rh123 是一种亲脂性阳离子荧光染料,对细胞膜具有通透性,线粒体膜尤敏感。细胞存活状态时,若丹明123 通过细胞膜,积聚于线粒体发出绿色荧光。在细胞凋亡时,线粒体膜的转运能力下降,电负性降低,故细胞线粒体积聚Rh123 的能力也丧失,荧光强度降低,据此检测细胞的凋亡变化。但应指出,在凋亡的早期阶段,由于胞膜尚完整,大多数细胞器和细胞功能相对较好,因此,Rh123 法对于早期凋亡细胞和活细胞的鉴别比较困难。5 　原位末端标记技术细胞凋亡时,DNA 断裂早于形态学改变及DNA 含量减少,原位末端标记( ISEL) 是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶和DNA 的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断裂相结合,较前述方面具更高灵敏性。通常有两种方法: ①DNA 聚合酶I 或klenow 大片段介导的单位缺口平移( INST) ; ②末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记( TUNEL) 。INST 是利用DNA 多聚酶将核苷酸整合到凋亡细胞内断裂的DNA 处的3"末端,同时水解5"末端,以修复DNA ,若使用已标记的核苷酸即可显示出有断裂DNA 的细胞。1993 年,Gorczyca 等提出了末端脱氧核糖核酸转移酶( TdT) 标记法采检测凋亡细胞的DNA 断裂,此种方法已得到广泛应用。由于内源性核酸内切酶激活,细胞自身的染色质或DNA 被切割,并产生与DNA 断点数目相同的3"2 羟基末端, TdT 可以将生物素化的dUTP 标记至3"2 羟基末端,通过卵白素2FITC 系统,使DNA 的断点部位发生特异荧光而签别出凋亡细胞,TdT 末端标记法是鉴别凋亡细胞比较特异的一种方法。脑组织中的凋亡细胞很少,因此基因组DNA 片断需要更灵敏的检测技术。将TUNEL 法与FCM 结合起来可以提高检测凋亡细胞中DNA 片断的灵敏度。经凋亡诱导因子处理一定时间后的细胞,原位末端标记的凋亡比Hoechst33342 染色显示的要多,提示TUNEL 可检测出尚未出现明显凋亡形态学特征但已发生DNA 裂解的核,从而使检测的灵敏度提高。对比研究表明, TUNEL 的敏感性远远高于ISNT ,尤其在APO早期TUNEL 法阳性率较高,可能是APO 发生时DNA 多数为双链同时断裂,单链少见的原因。后者是依赖DNA 多聚酶介导的修复反应,故ISNT 的阳性率相对较低。TUNEL 还可结合细胞同期的分析,可同时了解凋亡细胞DNA 断裂和细胞周期分布之间的关系,近来已成为鉴别和定量凋亡细胞的最常用方法之一。但由于断裂DNA 的标记过程比较复杂,涉及多种因素,所以末端标记的阴性结果并不一定代表DNA链的完整,应排除方法上的问题,如TdT 酶活力的丧失等诸多影响因素。因此应用TdT 末端标记法鉴别凋亡细胞必须同时设阳性及阴性对照组,以便得到可靠结果。6 　Annexin V/ PI 法1992 年Fadok 报道在APO 早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin ,PS) 迁移至细胞外侧,这一现象出现在核染色质变性与核体积缩小之前。AnnexinV 是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高亲合力,尤其与带负电荷的磷脂如PS 具极强的结合力,利用其特性可以检测细胞凋亡。但坏死细胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 结合阳性,因此使用Annexin V 这一参数不能区分坏死或凋亡,必须同时采用PI 这一参数将坏死细胆区分开来。FCM 通过Annexin V —FITC 标志暴露于细胞膜上的PS 结合PI 进入损伤细胞膜标记降解DNA 分析凋亡与坏死细胞。在检测时有4个亚群包括机械性损伤细胞(Annexin - / P1 + ) 、正常细胞(An2nexin - / PI - ) 、凋亡细胞(Annexin + / PI - ) 和继发性坏死细胞(Annexin + / PI + ) 被区分。Boersma 等应用Ampexin V2FITE染色法检测细胞毒药物处理后的中国仓鼠细胞凋亡变化,FCM 检测发现荧光信号强弱不同的两种细胞亚群。进一步形态学等证实弱荧光细胞亚群代表早期凋亡细胞,强荧光亚群代表晚期凋亡细胞,可见其是检测和定量凋亡细胞的一种较为可靠的方法。细胞凋亡时膜上PS 外露早于DNA 断裂发生,因此该法检测早期凋亡更为灵敏,且该法不需要固定细胞,避免了PI 法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL 法因固定出现的DNA 片段丢失,因此更加省时,结果亦更可靠,是目前最为理想的凋亡定量检测方法。7 　其　他7.1 　ssDNA 单抗法　把抗单链DNA(ssDNA) 单克隆抗体用于细胞凋亡的检测,是一种偶然发现,因为在应用ssDNA 单抗(荧光法) 检测细胞毒性药物诱导DNA 损伤中,观察到凋亡的白血病细胞(MOL T24) 有较强的荧光,后来经过适当的改进,证明ssDNA 单抗可以特异地识别凋亡细胞。与TUNEL法相比,ssDNA 具有更强的灵敏性。TUNEL 法检测的凋亡细胞可能只是单抗法检测的凋亡细胞中的一个亚类。ssDNA法检测APO 一般用免疫荧光法。但也可和FCM 结合应用。单抗法使用简便、成本低、应用广泛。ssDNA 单抗可以区别坏死和凋亡、甚至能检测前期凋亡,凋亡后坏亡和一些特殊的凋亡形式(如无片段化的细胞凋亡) 。因此, ssDNA 单抗法可望成为一种新的特异灵敏检测细胞凋亡的方法。7.2 　细胞凋亡的相关蛋白分析　研究发现,有不少基因参加凋亡调控,这些基因产物可参与促进或抑制APO 的发生、发展,因此检测凋亡调节基因蛋白对研究APO 及其调控有重要作用。迄今为止,已可对大量细胞凋亡调节基因的蛋白产物分析,如P53 蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等。FCM 用荧光标记的各种调控蛋白单抗染色,收集不同波长的荧光信号,检测细胞膜表面或细胞内荧光分子数量,可以了解每个细胞的变化,而且所需样品少,方法简便、快捷、准确。8 　展　望近几年来,随着FCM 技术的不断发展和APO 研究的逐渐深入,FCM 在细胞凋亡研究中日益广泛。应用FCM 定量检测凋亡细胞简便、快速、客观,并可进行多参数检测,因此,可同时对APO 及其相关的癌基因表达、细胞周期分布等诸多因素进行相关分析,可以比较深入地了解凋亡的调节机制。尽管应用FCM 进行细胞凋亡研究的方法较多,但FCM检测凋亡细胞的方法一般基于细胞凋亡过程中形态、生化等某一方面的特性,因而难于了解凋亡过程中发生的各种变化的相互关系,也使该类方法缺乏特异性,所以,联合应用多种针对不同特性的FCM 检测方法,才能更为有效地鉴别凋亡细胞。同时,FCM 研究结果尚需同时结合形态学观察或生物化学方法,才能更加深入地了解凋亡细胞的生物学特性。随着生物技术的发展及人们对APO 本质认识的深入,相信在不久的将来,定会有更为特异和敏感的方法问世,有助于细胞凋亡取得突破性进展。

1) PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测：PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。美国著名生物试剂公司CLONTECH和Invitrogen公司分别开发了多种标记的AnnexinV产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。2)细胞内氧化还原状态改变的检测：这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetection Kit通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。正常状态下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。3)细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1（apoptoticprotease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。4) 线粒体膜电位变化的检测：在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlertMitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：1) TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3"-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。2) LM-PCR Ladder （连接介导的PCR检测）当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCRLadder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR），连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。3) Telemerase Detection （端粒酶检测）这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-ezeTelemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNALadder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1．光学显微镜和倒置显微镜1． 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。2． 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2．荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3．透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维护正常组织和器官的细胞恒定与生长平衡，乃至机体衰老方面都起着重要作用。因此，有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展,凋亡细胞的检测方法显得非常重要。流式细胞仪(Flow cytometry ,FCM) 将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集于一体,较其它方法有不可比拟的优越性，既可定性又可定量,且具有简单、快速和敏感性高的特点,可进行多参数和活体细胞分析。在APO的研究得到较为广泛的应用，开辟了新途径。1 光散射法在FCM 系统中，被检细胞在液流中通过仪器测量区时,经激光照射,细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线,其中前向散射光( FSC) 的强度与细胞大小有关,而侧向散射光(SSC) 的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,核碎裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞FSC 降低而SSC 增高。细胞坏死由于胞体肿胀,细胞核亦碎裂分解故FSC 和SCC 均增高。正常细胞FSC 高而SSC 低。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞表面免疫荧光分析结合起来,用以区别辩认经这些特殊处理发生选择凋亡的淋巴细胞亚型,也可用于活细胞分类。值得注意的是,根据FSC和SSC 判断凋亡细胞的可靠性受被测细胞形态上的均一性和核细胞浆比率影响很大,因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好而在肿瘤细胞凋亡中其可靠性较差。2 　细胞DNA 含量的测定细胞凋亡时,核酸内切酶激活,导致DNA断裂,这是凋亡的特征性表现,也为FCM 鉴别凋亡细胞奠定了基础。而检测细胞凋亡DNA 断裂的方法中,最常用、最简便的就是细胞DNA 含量分析。当细胞用乙醇、TrtionX—100 处理后细胞膜上出现漏洞,小片段DNA 从细胞内释放出来,使其DNA 含量低于正常细胞的二倍体。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍体C0/ G1 ,峰前出现“亚二倍体”峰,即细胞凋亡峰(APO峰) ,根据APO 峰可测出凋亡细胞百分率,该法简单易行,可大批定量检测凋亡标本,亦可同时分析细胞的细胞周期位置。另外,应用FCM 方法通过对DNA 和RNA 的联合检测可以鉴别出G0 期细胞,因此,可分析细胞凋亡与G1 或G0 细胸的关系。DNA 降解的程度取决于凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因子的特性。染色过程中DNA 的逸出量变化也影响FCM 检测结果。据研究,将高浓度的磷酸盐———枸椽酸盐缓冲液加入漂洗液中,可增高降解DNA 的逸出量,从而提高鉴别凋亡细胞与正常细胞的能力。DNA含量测定在检测细胞凋亡中的局限性在于其特异性和敏感性均不高。特异性不高是因为APO 峰代表了一组细胞群体,包括凋亡细胞、机械损伤细胞、低DNA含量的细胞或不同染色体结构的细胞,在上述情况下,DNA 与荧光染料的结合量均小。另外,非固定的细胞在低渗溶液中被溶解时,可导致大量的核碎片出现,此时APO 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目,并不代表凋亡细胞数目。敏感性较差的原因是细胞凋亡早期只有DNA 断裂点出现,但尚未出现DNA 片段的大量丢失,所以该法不能检出早期凋亡细胞和发生于S 期或G2/ M 期的凋亡细胞,因为其实际含量不低于二倍体细胞所含的DNA ,因此该法进行凋亡细胞分析时应结合其它形态或生化方法,以期更准确地分析细胞的凋亡状态。3 　Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)AO可将细胞或细胞核中的双链DNA 和变性DNA 染成不同颜色的荧光。AO 插入双链DNA 中时,发绿色荧光;AO也可与单链或通过变性而产生的DNA 单链发生作用,这时发出红色荧光,因此,通过FCM 检测不同的荧光,可判断凋亡的发生。在测定被标准化后,绿色和红色荧光强度的量与总DNA 含量成比例,红色荧光与总体细胞(红色加绿色) 荧光的比率表示细胞中变性DNA 的比例,因此,这种方法可用于评价DNA 对原位变性的敏感性。有时候,凋亡细胞DNA 降解不明显,依赖于DNA 降解来检测细胞凋亡的方法如细胞DNA含量测定、DNA 末端标记等就难以检测到细胞凋亡变化。AO法检测凋亡的原理不依赖于DNA 片断的产生,因此其最主要的优点是可应用于寡核小体片段与凋亡不相平衡等情况,但AO 染色法不能有效区分有丝分裂细胞和凋亡细胞。4 　若丹明( Rh123) 染色法细胞生活状态下,胞膜上的钠-钾泵、钙泵等的作用,使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成细胞膜电位。FCM 可以检测亲脂性离子荧光染料在胞膜内外的分布,来测量膜电位的高低,以评价细胞的活力。Rh123 是一种亲脂性阳离子荧光染料,对细胞膜具有通透性,线粒体膜尤敏感。细胞存活状态时,若丹明123 通过细胞膜,积聚于线粒体发出绿色荧光。在细胞凋亡时,线粒体膜的转运能力下降,电负性降低,故细胞线粒体积聚Rh123 的能力也丧失,荧光强度降低,据此检测细胞的凋亡变化。但应指出,在凋亡的早期阶段,由于胞膜尚完整,大多数细胞器和细胞功能相对较好,因此,Rh123法对于早期凋亡细胞和活细胞的鉴别比较困难。5 　原位末端标记技术细胞凋亡时,DNA 断裂早于形态学改变及DNA 含量减少,原位末端标记( ISEL) 是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶和DNA 的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断裂相结合,较前述方面具更高灵敏性。通常有两种方法: ①DNA 聚合酶I 或klenow大片段介导的单位缺口平移( INST) ; ②末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记( TUNEL) 。INST 是利用DNA 多聚酶将核苷酸整合到凋亡细胞内断裂的DNA 处的3"末端,同时水解5"末端,以修复DNA ,若使用已标记的核苷酸即可显示出有断裂DNA 的细胞。1993 年,Gorczyca 等提出了末端脱氧核糖核酸转移酶( TdT) 标记法采检测凋亡细胞的DNA 断裂,此种方法已得到广泛应用。由于内源性核酸内切酶激活,细胞自身的染色质或DNA 被切割,并产生与DNA 断点数目相同的3"2 羟基末端, TdT 可以将生物素化的dUTP 标记至3"2 羟基末端,通过卵白素2FITC 系统,使DNA 的断点部位发生特异荧光而签别出凋亡细胞,TdT 末端标记法是鉴别凋亡细胞比较特异的一种方法。脑组织中的凋亡细胞很少,因此基因组DNA 片断需要更灵敏的检测技术。将TUNEL 法与FCM 结合起来可以提高检测凋亡细胞中DNA 片断的灵敏度。经凋亡诱导因子处理一定时间后的细胞,原位末端标记的凋亡比Hoechst33342 染色显示的要多,提示TUNEL 可检测出尚未出现明显凋亡形态学特征但已发生DNA 裂解的核,从而使检测的灵敏度提高。对比研究表明, TUNEL 的敏感性远远高于ISNT ,尤其在APO早期TUNEL 法阳性率较高,可能是APO 发生时DNA 多数为双链同时断裂,单链少见的原因。后者是依赖DNA 多聚酶介导的修复反应,故ISNT 的阳性率相对较低。TUNEL 还可结合细胞同期的分析,可同时了解凋亡细胞DNA 断裂和细胞周期分布之间的关系,近来已成为鉴别和定量凋亡细胞的最常用方法之一。但由于断裂DNA 的标记过程比较复杂,涉及多种因素,所以末端标记的阴性结果并不一定代表DNA链的完整,应排除方法上的问题,如TdT 酶活力的丧失等诸多影响因素。因此应用TdT 末端标记法鉴别凋亡细胞必须同时设阳性及阴性对照组,以便得到可靠结果。6 　Annexin V/ PI 法1992 年Fadok 报道在APO 早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin,PS) 迁移至细胞外侧,这一现象出现在核染色质变性与核体积缩小之前。AnnexinV 是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高亲合力,尤其与带负电荷的磷脂如PS 具极强的结合力,利用其特性可以检测细胞凋亡。但坏死细胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 结合阳性,因此使用Annexin V 这一参数不能区分坏死或凋亡,必须同时采用PI 这一参数将坏死细胆区分开来。FCM 通过Annexin V —FITC 标志暴露于细胞膜上的PS 结合PI 进入损伤细胞膜标记降解DNA 分析凋亡与坏死细胞。在检测时有4个亚群包括机械性损伤细胞(Annexin - / P1 + ) 、正常细胞(An2nexin - / PI - )、凋亡细胞(Annexin + / PI - ) 和继发性坏死细胞(Annexin + / PI + ) 被区分。Boersma 等应用Ampexin V2FITE染色法检测细胞毒药物处理后的中国仓鼠细胞凋亡变化,FCM 检测发现荧光信号强弱不同的两种细胞亚群。进一步形态学等证实弱荧光细胞亚群代表早期凋亡细胞,强荧光亚群代表晚期凋亡细胞,可见其是检测和定量凋亡细胞的一种较为可靠的方法。细胞凋亡时膜上PS外露早于DNA 断裂发生,因此该法检测早期凋亡更为灵敏,且该法不需要固定细胞,避免了PI 法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL 法因固定出现的DNA 片段丢失,因此更加省时,结果亦更可靠,是目前最为理想的凋亡定量检测方法。7 　其　他7.1 　ssDNA 单抗法　把抗单链DNA(ssDNA) 单克隆抗体用于细胞凋亡的检测,是一种偶然发现,因为在应用ssDNA 单抗(荧光法) 检测细胞毒性药物诱导DNA 损伤中,观察到凋亡的白血病细胞(MOL T24) 有较强的荧光,后来经过适当的改进,证明ssDNA 单抗可以特异地识别凋亡细胞。与TUNEL法相比,ssDNA 具有更强的灵敏性。TUNEL 法检测的凋亡细胞可能只是单抗法检测的凋亡细胞中的一个亚类。ssDNA法检测APO 一般用免疫荧光法。但也可和FCM 结合应用。单抗法使用简便、成本低、应用广泛。ssDNA 单抗可以区别坏死和凋亡、甚至能检测前期凋亡,凋亡后坏亡和一些特殊的凋亡形式(如无片段化的细胞凋亡) 。因此, ssDNA 单抗法可望成为一种新的特异灵敏检测细胞凋亡的方法。7.2 　细胞凋亡的相关蛋白分析　研究发现,有不少基因参加凋亡调控,这些基因产物可参与促进或抑制APO 的发生、发展,因此检测凋亡调节基因蛋白对研究APO 及其调控有重要作用。迄今为止,已可对大量细胞凋亡调节基因的蛋白产物分析,如P53 蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等。FCM 用荧光标记的各种调控蛋白单抗染色,收集不同波长的荧光信号,检测细胞膜表面或细胞内荧光分子数量,可以了解每个细胞的变化,而且所需样品少,方法简便、快捷、准确。8 　展　望近几年来,随着FCM技术的不断发展和APO 研究的逐渐深入,FCM 在细胞凋亡研究中日益广泛。应用FCM 定量检测凋亡细胞简便、快速、客观,并可进行多参数检测,因此,可同时对APO 及其相关的癌基因表达、细胞周期分布等诸多因素进行相关分析,可以比较深入地了解凋亡的调节机制。尽管应用FCM 进行细胞凋亡研究的方法较多,但FCM检测凋亡细胞的方法一般基于细胞凋亡过程中形态、生化等某一方面的特性,因而难于了解凋亡过程中发生的各种变化的相互关系,也使该类方法缺乏特异性,所以,联合应用多种针对不同特性的FCM检测方法,才能更为有效地鉴别凋亡细胞。同时,FCM 研究结果尚需同时结合形态学观察或生物化学方法,才能更加深入地了解凋亡细胞的生物学特性。随着生物技术的发展及人们对APO 本质认识的深入,相信在不久的将来,定会有更为特异和敏感的方法问世,有助于细胞凋亡取得突破性进展。

1) PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测：PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。美国著名生物试剂公司CLONTECH和Invitrogen公司分别开发了多种标记的Annexin V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。2)细胞内氧化还原状态改变的检测：这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM GlutathioneDetection Kit通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。正常状态下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。3)细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1 （apoptoticprotease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。4) 线粒体膜电位变化的检测：在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：1) TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3"-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。2) LM-PCR Ladder （连接介导的PCR检测）当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated PCR），连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。3) Telemerase Detection （端粒酶检测）这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA Ladder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒.同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1．光学显微镜和倒置显微镜1． 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。2． 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2．荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3．透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维护正常组织和器官的细胞恒定与生长平衡，乃至机体衰老方面都起着重要作用。因此，有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展,凋亡细胞的检测方法显得非常重要。流式细胞仪( Flow cytometry ,FCM) 将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集于一体,较其它方法有不可比拟的优越性，既可定性又可定量,且具有简单、快速和敏感性高的特点,可进行多参数和活体细胞分析。在APO 的研究得到较为广泛的应用，开辟了新途径。1 光散射法在FCM 系统中，被检细胞在液流中通过仪器测量区时,经激光照射,细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线,其中前向散射光( FSC) 的强度与细胞大小有关,而侧向散射光(SSC) 的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,核碎裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞FSC 降低而SSC 增高。细胞坏死由于胞体肿胀,细胞核亦碎裂分解故FSC 和SCC 均增高。正常细胞FSC 高而SSC 低。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞表面免疫荧光分析结合起来,用以区别辩认经这些特殊处理发生选择凋亡的淋巴细胞亚型,也可用于活细胞分类。值得注意的是,根据FSC 和SSC 判断凋亡细胞的可靠性受被测细胞形态上的均一性和核细胞浆比率影响很大,因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好而在肿瘤细胞凋亡中其可靠性较差。2 　细胞DNA 含量的测定细胞凋亡时,核酸内切酶激活,导致DNA 断裂,这是凋亡的特征性表现,也为FCM 鉴别凋亡细胞奠定了基础。而检测细胞凋亡DNA 断裂的方法中,最常用、最简便的就是细胞DNA 含量分析。当细胞用乙醇、TrtionX—100 处理后细胞膜上出现漏洞,小片段DNA 从细胞内释放出来,使其DNA 含量低于正常细胞的二倍体。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍体C0/ G1 ,峰前出现“亚二倍体”峰,即细胞凋亡峰(APO峰) ,根据APO 峰可测出凋亡细胞百分率,该法简单易行,可大批定量检测凋亡标本,亦可同时分析细胞的细胞周期位置。另外,应用FCM 方法通过对DNA 和RNA 的联合检测可以鉴别出G0 期细胞,因此,可分析细胞凋亡与G1 或G0 细胸的关系。DNA 降解的程度取决于凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因子的特性。染色过程中DNA 的逸出量变化也影响FCM 检测结果。据研究,将高浓度的磷酸盐———枸椽酸盐缓冲液加入漂洗液中,可增高降解DNA 的逸出量,从而提高鉴别凋亡细胞与正常细胞的能力。DNA 含量测定在检测细胞凋亡中的局限性在于其特异性和敏感性均不高。特异性不高是因为APO 峰代表了一组细胞群体,包括凋亡细胞、机械损伤细胞、低DNA 含量的细胞或不同染色体结构的细胞,在上述情况下,DNA 与荧光染料的结合量均小。另外,非固定的细胞在低渗溶液中被溶解时,可导致大量的核碎片出现,此时APO 峰的细胞数目只代表了核碎片的数目,并不代表凋亡细胞数目。敏感性较差的原因是细胞凋亡早期只有DNA 断裂点出现,但尚未出现DNA 片段的大量丢失,所以该法不能检出早期凋亡细胞和发生于S 期或G2/ M 期的凋亡细胞,因为其实际含量不低于二倍体细胞所含的DNA ,因此该法进行凋亡细胞分析时应结合其它形态或生化方法,以期更准确地分析细胞的凋亡状态。3 　Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)AO 可将细胞或细胞核中的双链DNA 和变性DNA 染成不同颜色的荧光。AO 插入双链DNA 中时,发绿色荧光;AO也可与单链或通过变性而产生的DNA 单链发生作用,这时发出红色荧光,因此,通过FCM 检测不同的荧光,可判断凋亡的发生。在测定被标准化后,绿色和红色荧光强度的量与总DNA 含量成比例,红色荧光与总体细胞(红色加绿色) 荧光的比率表示细胞中变性DNA 的比例,因此,这种方法可用于评价DNA 对原位变性的敏感性。有时候,凋亡细胞DNA 降解不明显,依赖于DNA 降解来检测细胞凋亡的方法如细胞DNA含量测定、DNA 末端标记等就难以检测到细胞凋亡变化。AO法检测凋亡的原理不依赖于DNA 片断的产生,因此其最主要的优点是可应用于寡核小体片段与凋亡不相平衡等情况,但AO 染色法不能有效区分有丝分裂细胞和凋亡细胞。4 　若丹明( Rh123) 染色法细胞生活状态下,胞膜上的钠- 钾泵、钙泵等的作用,使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成细胞膜电位。FCM 可以检测亲脂性离子荧光染料在胞膜内外的分布,来测量膜电位的高低,以评价细胞的活力。Rh123 是一种亲脂性阳离子荧光染料,对细胞膜具有通透性,线粒体膜尤敏感。细胞存活状态时,若丹明123 通过细胞膜,积聚于线粒体发出绿色荧光。在细胞凋亡时,线粒体膜的转运能力下降,电负性降低,故细胞线粒体积聚Rh123 的能力也丧失,荧光强度降低,据此检测细胞的凋亡变化。但应指出,在凋亡的早期阶段,由于胞膜尚完整,大多数细胞器和细胞功能相对较好,因此,Rh123 法对于早期凋亡细胞和活细胞的鉴别比较困难。5 　原位末端标记技术细胞凋亡时,DNA 断裂早于形态学改变及DNA 含量减少,原位末端标记( ISEL) 是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶和DNA 的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断裂相结合,较前述方面具更高灵敏性。通常有两种方法: ①DNA 聚合酶I 或klenow 大片段介导的单位缺口平移( INST) ; ②末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记( TUNEL) 。INST 是利用DNA 多聚酶将核苷酸整合到凋亡细胞内断裂的DNA 处的3"末端,同时水解5"末端,以修复DNA ,若使用已标记的核苷酸即可显示出有断裂DNA 的细胞。1993 年,Gorczyca 等提出了末端脱氧核糖核酸转移酶( TdT) 标记法采检测凋亡细胞的DNA 断裂,此种方法已得到广泛应用。由于内源性核酸内切酶激活,细胞自身的染色质或DNA 被切割,并产生与DNA 断点数目相同的3"2 羟基末端, TdT 可以将生物素化的dUTP 标记至3"2 羟基末端,通过卵白素2FITC 系统,使DNA 的断点部位发生特异荧光而签别出凋亡细胞,TdT 末端标记法是鉴别凋亡细胞比较特异的一种方法。脑组织中的凋亡细胞很少,因此基因组DNA 片断需要更灵敏的检测技术。将TUNEL 法与FCM 结合起来可以提高检测凋亡细胞中DNA 片断的灵敏度。经凋亡诱导因子处理一定时间后的细胞,原位末端标记的凋亡比Hoechst33342 染色显示的要多,提示TUNEL 可检测出尚未出现明显凋亡形态学特征但已发生DNA 裂解的核,从而使检测的灵敏度提高。对比研究表明, TUNEL 的敏感性远远高于ISNT ,尤其在APO早期TUNEL 法阳性率较高,可能是APO 发生时DNA 多数为双链同时断裂,单链少见的原因。后者是依赖DNA 多聚酶介导的修复反应,故ISNT 的阳性率相对较低。TUNEL 还可结合细胞同期的分析,可同时了解凋亡细胞DNA 断裂和细胞周期分布之间的关系,近来已成为鉴别和定量凋亡细胞的最常用方法之一。但由于断裂DNA 的标记过程比较复杂,涉及多种因素,所以末端标记的阴性结果并不一定代表DNA链的完整,应排除方法上的问题,如TdT 酶活力的丧失等诸多影响因素。因此应用TdT 末端标记法鉴别凋亡细胞必须同时设阳性及阴性对照组,以便得到可靠结果。6 　Annexin V/ PI 法1992 年Fadok 报道在APO 早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin ,PS) 迁移至细胞外侧,这一现象出现在核染色质变性与核体积缩小之前。AnnexinV 是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高亲合力,尤其与带负电荷的磷脂如PS 具极强的结合力,利用其特性可以检测细胞凋亡。但坏死细胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 结合阳性,因此使用Annexin V 这一参数不能区分坏死或凋亡,必须同时采用PI 这一参数将坏死细胆区分开来。FCM 通过Annexin V —FITC 标志暴露于细胞膜上的PS 结合PI 进入损伤细胞膜标记降解DNA 分析凋亡与坏死细胞。在检测时有4个亚群包括机械性损伤细胞(Annexin - / P1 + ) 、正常细胞(An2nexin - / PI - ) 、凋亡细胞(Annexin + / PI - ) 和继发性坏死细胞(Annexin + / PI + ) 被区分。Boersma 等应用Ampexin V2FITE染色法检测细胞毒药物处理后的中国仓鼠细胞凋亡变化,FCM 检测发现荧光信号强弱不同的两种细胞亚群。进一步形态学等证实弱荧光细胞亚群代表早期凋亡细胞,强荧光亚群代表晚期凋亡细胞,可见其是检测和定量凋亡细胞的一种较为可靠的方法。细胞凋亡时膜上PS 外露早于DNA 断裂发生,因此该法检测早期凋亡更为灵敏,且该法不需要固定细胞,避免了PI 法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL 法因固定出现的DNA 片段丢失,因此更加省时,结果亦更可靠,是目前最为理想的凋亡定量检测方法。7 　其　他7.1 　ssDNA 单抗法　把抗单链DNA(ssDNA) 单克隆抗体用于细胞凋亡的检测,是一种偶然发现,因为在应用ssDNA 单抗(荧光法) 检测细胞毒性药物诱导DNA 损伤中,观察到凋亡的白血病细胞(MOL T24) 有较强的荧光,后来经过适当的改进,证明ssDNA 单抗可以特异地识别凋亡细胞。与TUNEL法相比,ssDNA 具有更强的灵敏性。TUNEL 法检测的凋亡细胞可能只是单抗法检测的凋亡细胞中的一个亚类。ssDNA法检测APO 一般用免疫荧光法。但也可和FCM 结合应用。单抗法使用简便、成本低、应用广泛。ssDNA 单抗可以区别坏死和凋亡、甚至能检测前期凋亡,凋亡后坏亡和一些特殊的凋亡形式(如无片段化的细胞凋亡) 。因此, ssDNA 单抗法可望成为一种新的特异灵敏检测细胞凋亡的方法。7.2 　细胞凋亡的相关蛋白分析　研究发现,有不少基因参加凋亡调控,这些基因产物可参与促进或抑制APO 的发生、发展,因此检测凋亡调节基因蛋白对研究APO 及其调控有重要作用。迄今为止,已可对大量细胞凋亡调节基因的蛋白产物分析,如P53 蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等。FCM 用荧光标记的各种调控蛋白单抗染色,收集不同波长的荧光信号,检测细胞膜表面或细胞内荧光分子数量,可以了解每个细胞的变化,而且所需样品少,方法简便、快捷、准确。8 　展　望近几年来,随着FCM 技术的不断发展和APO 研究的逐渐深入,FCM 在细胞凋亡研究中日益广泛。应用FCM 定量检测凋亡细胞简便、快速、客观,并可进行多参数检测,因此,可同时对APO 及其相关的癌基因表达、细胞周期分布等诸多因素进行相关分析,可以比较深入地了解凋亡的调节机制。尽管应用FCM 进行细胞凋亡研究的方法较多,但FCM检测凋亡细胞的方法一般基于细胞凋亡过程中形态、生化等某一方面的特性,因而难于了解凋亡过程中发生的各种变化的相互关系,也使该类方法缺乏特异性,所以,联合应用多种针对不同特性的FCM 检测方法,才能更为有效地鉴别凋亡细胞。同时,FCM 研究结果尚需同时结合形态学观察或生物化学方法,才能更加深入地了解凋亡细胞的生物学特性。随着生物技术的发展及人们对APO 本质认识的深入,相信在不久的将来,定会有更为特异和敏感的方法问世,有助于细胞凋亡取得突破性进展。

会不会

线粒体：细胞呼吸，提供能量。叶绿体：植物体光合作用的场所。核糖体：合成蛋白质（主要），原核细胞中唯一的细胞器（可用于制抗生素）内质网：①滑面内质网：加工脂质，②粗面内质网：加工，合成蛋白质。高尔基体：加工蛋白质，分泌，细胞壁的合成。液泡：调节植物细胞内的环境，使植物细胞坚挺。溶酶体：分解衰老，损伤细胞。中心体：细胞的有丝分裂。

小鼠mdsc和中性粒细胞怎么区分中性粒细胞(PMN)是机体防御系统的主要组成部分，能吞噬和杀灭多种致病原。致病原与血清中的特异性抗体(IgG)结合后,通过IgG的Fc部分与PMN表面的受体——FcγRⅢ(CD16b)相结合，从而被吞噬。FcγRⅢ有a、b两种类型，FcγRⅢa(CD16a)是一种跨膜糖蛋白，PMN表面的FcγRⅢb(CD16b)是一种糖肌醇磷脂蛋白(GPI-锚蛋白)［1］。近年发现阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者在血细胞表面缺失各种特异的GPI-锚蛋白，CD16b正是这类蛋白之一。为探讨PMN表面CD16b的缺失与PMN释放氧自由基杀菌功能的关系，将我们的研究报告如下。材料和方法1　标本采集　正常人外周血取自协和医院血库正常献血者，正常骨髓取自协和医院胸外科手术患者的肋骨，PNH患者按1987年全国溶血性贫血会议拟定的诊断标准，并经流式细胞仪免疫荧光法检测CD59标记率进一步确诊。2　中性粒细胞的分离　 新鲜的外周血或骨髓，用肝素抗凝，经淋巴细胞分离液分离，去除淋巴细胞和单个核细胞，用右旋糖酐(dextran，分子量=7～11 万) 沉降和低渗法去除红细胞，得到纯净的中性粒细胞。用台盼蓝染色法检查细胞活力，须保证细胞存活率大于95%。3　间接免疫荧光法检测CD16　取1×106个细胞，悬浮于100μl 2% BSA中，室温封闭30分钟，加 CD16单克隆抗体(Immunotech SA公司产品)，在室温作用30分钟后，用PBS洗涤2次，再悬浮于100μl 2％BSA中，加FITC 标记的羊抗鼠IgG(Gibco公司产品)室温暗染20分钟后洗去二抗。用500μl PBS悬浮细胞，用流式细胞仪检测CD16 标记率。4　中性粒细胞功能测定　 佛波醇酯(PMA，Sigma产品，用DMSO溶解，配制成1mg/ml，储存于－20℃，临用前稀释)能激活中性粒细胞，使之释放活性氧，其中O-2*和H2O2能与化学发光剂Luminol(3-氨基苯二甲酰肼，北京化工厂)反应而发光。用LKB-1250发光仪(Luminometer)检测。正常人和PNH患者中性粒细胞，制备成细胞悬液(107 /ml)与 100nmol/L PMA 反应，37℃15分钟,置于冰上终止反应，取含1×105 细胞的激活液加入到1ml 0.1nmol/L 的Luminol 溶液中，立即测定发光值，每一数值测定3次以上， 取平均值。取正常人的不同细胞数，测定发光值，结果显示发光值与细胞数有良好的线性关系，说明此方法具有可靠性 (附图)。附图　细胞数与发光值的线性关系5　细胞培养　以 1×106个细胞/ml的密度接种PMN于IMDM培养基(含10%自身血清)，37℃、5% CO2分别培养12，16，20小时。6　细胞形态学观察　不同培养时间的细胞用瑞氏染色，光学显微镜下观察。7　DNA含量分析　取细胞1×106，PBS洗2遍，以70%冷乙醇(4℃)固定12小时以上，用PBS洗去乙醇，加入0.5ml柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 7.8)室温作用5分钟，离心后以PBS重悬细胞，加入 RNaseA (终浓度60μg/ml)37℃作用30分钟，再加入碘化乙锭(PI，终浓度50μg/ml)4℃暗染30分钟，以染细胞内总DNA，用流式细胞仪分析正常细胞和凋亡细胞，计算凋亡率。

follicle发育是一个复杂的动态过程。follicle被包裹在基质中，一旦follicle发育，follicle就会在不断生长的过程中从皮层移动到髓质，最后到达皮层排卵 。许多这些过程不能仅用毛囊来解释。 通过对小鼠出生后follicle发育关键时间点的单细胞和空间转录组测序，发现ovarian基质细胞不仅是构成 ovarian的主要细胞群之一，其细胞群和空间位置也与follicle发育密切相关 。通过对 细胞通讯的分析发现， ovarian基质细胞是细胞间通讯的主要传递者，它们发出的许多信号被颗粒细胞和卵母细胞接收，参与follicle发育 。 ovarian基质细胞不是同质细胞群。 将单细胞类型与其空间位置信息相结合，将 ovarian基质细胞分为四种类型，即结构性基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，每种类型在follicle发育中发挥不同的功能 。对不同空间位置和不同类型基质细胞的深入研究将扩大对follicle发育动态的理解，为 ovarian相关疾病的治疗带来新的靶点和新方法。 ovarian由两部分组成： 实质和间质 。 follicle是 ovarian的功能单位，包括 ovarian实质，决定了女性的生殖寿命 。它由卵母细胞和嵌入 ovarian基质中的体细胞层（颗粒细胞和膜细胞）组成。 ovarian的大部分，包括皮质和髓质，由具有不同特征的基质组成。大多数follicle嵌入 ovarian皮质的基质中，并在 ovarian髓质的基质中成熟。历史上， ovarian生物学的研究主要集中在受卵母细胞和颗粒细胞（GCs）控制的follicle发生上，而follicle发生中存在许多未解决的问题，仅靠这两种细胞类型无法解释。除了构成follicle的细胞外，嵌入follicle的 ovarian基质对follicle发生有很大贡献，但没有得到足够的重视，因为它是理解follicle发生复杂过程的关键。 ovarian基质由一般成分组成，例如免疫细胞、血管、神经、细胞外基质和未完全表征的基质细胞的混合群体 。大部分 ovarian基质包含未完全表征的基质细胞，包括成纤维细胞样、梭形细胞形和间质细胞。 ovarian基质细胞在follicle发生中具有重要作用，特别是在原始follicle的激活和膜细胞的分化中 。次级follicle可以使用体外培养系统单独生长，而原始和初级follicle必须在含有基质成分的器官培养物中激活。此外，所有在体外培养后成功生产人中期 II (MII) 卵子的研究都使用机械方法而不是酶消化来从 ovarian组织中分离follicle，因为酶消化会对follicle造成损害，同时还能保持残留基质细胞的紧密结合，这些细胞与follicle进行密集的细胞间通讯，并可能具有分化成其他关键细胞类型的能力，例如膜细胞。此外，基质细胞共培养可以改善早期follicle的生长和存活，这对于将体外培养系统成功转化为灵长类动物和人类follicle至关重要。 ovarian基质细胞不仅为follicle发育提供结构支持，而且与follicle具有复杂的双向旁分泌信号。几种生长因子是follicle发生的关键调节分子，包括成纤维细胞生长因子、转化生长因子 β、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子。然而， follicle和基质细胞之间的特定细胞 - 细胞分泌信号仍不清楚 。 尽管有这些新见解，但对 ovarian基质细胞的理解仍然有限，许多问题仍未得到解答。 ovarian基质细胞的不完整表征和分类导致研究中的混淆，这些研究报告了有关基质细胞的发现而没有进一步鉴定。 ovarian基质细胞不是指单个同质细胞群。最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究证实了多个基质细胞clusters的存在，但缺乏对整个 ovarian基质细胞类型的全面和完整的表征。基质细胞的分布和亚型可能会因其在 ovarian中的位置而异（例如，皮质与髓质）。 随着follicle的生长和排卵以及黄体的发育，基质细胞的分布也可能发生变化，伴随着周期性的结构变化。整个生殖寿命的变化也很明显，包括纤维化胶原蛋白的增加，如老年小鼠、女性和灵长类动物的 ovarian所示。对于这些不完全表征的基质细胞类型，仔细的本体论、进一步的标记识别以及对区域细微差别的关注是关键的下一步 。 在这项研究中， 生成了小鼠出生后 ovarian follicle发育的单细胞图谱和时空基因表达动态，阐明了 ovarian基质细胞在follicle发育中的重要作用。 细胞间通讯分析描绘了follicle发育不同阶段的细胞类型组之间复杂的细胞间通讯关系，并揭示 ovarian基质细胞是 ovarian中调节follicle发育的主要外向信号细胞类型 。 将 ovarian基质细胞完全表征为四个亚群，即结构基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，并进一步进行标记鉴定。 这些基质细胞亚群中的每一个在follicle发育中发挥不同的作用。 为了生成小鼠 ovarian的细胞图，说明follicle发育过程中的时间和空间变化， 通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和空间转录组学方法（10× Genomics Visium 载玻片和高分辨率显微镜） 。 五个时间点的 ovarian被整合到scRNA-seq 分析中：出生后第 3 天、第 5 天、第 7 天、3 周和 8 周。 三个时间点的 ovarian被整合到 10× Visium 分析中：出生后第 7 天、第 3 周和第 8 周。 后一种方法允许探索follicle发育中的细胞特征，以获得详细的细胞群和时间变化 。 能够生成 58,319 个细胞的 ovarian图谱，并根据其标记的表达识别出 21 个被分配细胞身份的clusters。 为了进一步识别clusters，根据已知的细胞类型标记基因分配clusters。 细胞特异性标记基因是卵母细胞（Sycp3）、颗粒细胞（Amhr2）、基质细胞（Col1a1）、内皮细胞（Cdh5）、上皮细胞（Krt19）、免疫细胞（Ptprc）、平滑肌细胞（Des）和 类固醇生成细胞 (Ptgfr)。 这些clusters可分为九个主要细胞类别：（i）基质细胞，（ii）颗粒细胞，（iii）卵母细胞，（iv）内皮细胞，（v）上皮细胞，（vi）免疫细胞，（vii）平滑细胞 肌肉细胞，（viii）类固醇生成细胞，和（ix）未定义的体细胞。 为了进一步获得基因特征的动态模式，鉴定了九个主要的细胞类别clusters特异性标记基因。 在这些细胞类型中，基质细胞和GCs占了绝大多数。 为了系统地绘制由 scRNA-seq 识别的细胞类型在 ovarian内的位置，使用了 10× Visium Spatial Transcriptomics 技术 。在第 7 天、第 3 周和第 8 周检查了三个 ovarian样本，它们代表了三个重要的 ovarian发育阶段。总体而言，使用统一流形近似（UMAP）和投影对九个转录不同的clusters进行分类和可视化。可以清楚地看到九个clusters的位置，伴随着follicle和黄体。然后， 将时空数据与 scRNA-seq 数据相结合，使用 SPOTlight 推断复杂 ovarian组织内细胞类型和状态的位置（关于SPOTlight，大家可以参考文章 10X空间转录组数据分析梳理 、 10X单细胞空间联合分析方法汇总及算法总结 、 10X单细胞空间分析回顾之SPOTlight ） 。如下所示， 将八个明确识别的细胞类别映射到 10×Visium 时空 ovarian组织中，发现基质细胞、内皮细胞和 GC 是卵母细胞周围的三个细胞类别 。可以看到 ovarian细胞类型的所有空间位置。 颗粒细胞（GCs）是follicle中不可或缺的一部分，直接与卵母细胞相互作用 。为了通过UMAP分析在调查期间剖析GC在发育过程中的异质性，将GC群体确定为11个clusters。为了获得基因特征的动态模式，鉴定了GC clusters特异性标记基因。 根据这些分析，绘制了一个遗传动态模型，包括在follicle发育过程中的低分化、mural、卵丘、类固醇生成和增殖性 GC 。已知在早期发育阶段 GC 中表达的基因是 Wt1 和 Foxl2；对于mural GC，Cyp19a1；对于卵丘细胞，Slc38a3 和 Amh；对于类固醇生成的 GC，Cyp11a1 和 Lhcgr。标记基因 Wt1、Slc38a3、Cyp19a1 和 Cyp11a1 在 10× Visium 切片中可视化，与真实的组织学位置相匹配。 低分化GCs的比例随着时间的推移而降低，而卵丘GCs、mural GCs和类固醇GCs的比例随着时间的推移而增加，并在3周或8周达到峰值 。结果与 ovarian和follicle发育过程中的 GC 动力学相匹配。然而，没有发现任何明显的边界来将原始follicle到窦follicle的 GC 分组。 为了剖析整个调查期间 GC 的命运决定，根据上面报道的基因表达，它们沿着伪时间轨迹排列 。获得了三个状态（在伪时间分析中使用的术语，其中“state”被分配来标记 Monocle 中轨迹树的片段）。此外，代表基因（上面确定的 3 个follicle形成阶段的标记基因）的表达以及伪时间轨迹与我们的推断一致。根状态包含大部分差异较小的 GC；状态 1 包含大部分积云 GC、mural GC 和增殖 GC；状态 3 包含大多数类固醇生成 GC。在这样的伪时间轨迹中，3 个分支暗示了具有细胞标记的 GC 的 3 个分化阶段，例如 Wnt6、Wt1、Hmgb2 和 Cyp11a1。对这三个州的代表性基因的 GO 分析显示了相关的途径。此外，分析了两种主要细胞群（基质细胞和 GC）与其他细胞类型之间的细胞串扰。如下图所示， 除了 GC 和其他细胞类型之间广泛的细胞间通讯外，基质细胞和其他 ovarian细胞类型之间的细胞间通讯也更强 。 为了分析这些细胞类型在小鼠 ovarian中的通讯，进一步进行了 CellChat 分析（关于CellChat，大家可以参考文章 10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析之CellChat 、 10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析CellChat之多样本通讯差异分析 ），以确定follicle发育过程中这些细胞类型之间的细胞通讯 。第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周的推断交互次数分别为 723、455、522、329 和 602，第 3 天的交互强度，第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周分别为 22.525、6.705、10.16、3.534 和 4.065。 发现第 3 天、第 7 天和第 8 周是细胞通讯的最强时间点 。因此，更多地关注第 3 天、第 7 天和第 8 周。 ovarian中的九种细胞类型之间存在非常复杂的细胞通讯，而基质细胞是信号最强的细胞类型 。进一步的信号传导作用分析表明，在六个重要的 ovarian发育时期， 基质细胞在细胞间通讯中表现出最强的外向相互作用 。 GCs 是在第 3、5 和 7 天接收最多传入受体信号的细胞类型，而上皮细胞是在 3 周和 8 周接收最多传入受体信号的类型。此外，在选定的时间过程中探索了特定类型的细胞通信。 发现基质细胞经常与所有其他细胞交流 。特别是，PTN、MK、ncWNT、PROS、GAS、ANGPTL 和 TWEAK 信号通路积极参与基质细胞的输出信号模式。在传出信号中，MK 在整个follicle发育阶段表达。 PTN 仅在第 3 天、第 5 天和第 7 天检测到，此时原始follicle激活和follicle发育为初级和次级follicle。比较了第 3 天和第 5 天，当原始follicle被激活时，发现 ncWnt、PROS、APELIN、GRN、CALCR、ACTIVIN、IFN-1 和 LIFR 在第 2 天特异性表达，而 IL -1 和 ANNEXIN 在第 5 天特异性表达。其他信号通路，如 TWEAK、PTN 和 MK，在第 5 天的表达水平高于第 5 天。当比较第 7 天和第 5 天的相对信息流时，发现IL-1、ANNEXIN、CCL、BMP、FGF 和 ENHO 在第 5 天特异性表达，而 TWEAK、APELIN、ANGPT、CALCR、CXCL、AMH、PERIOSTIN、PROS、EDN 和 MIF 在第 7 天特异性表达。其他信号通路，如 PTN 和 MK，在第 7 天的表达水平高于第 5 天。还将第 7 天的信号传导与第 3 周的信号传导进行比较，发现 PTN、TWEAK、EDN、MIF、TNF、WNT 、PERIOSTEIN、CXCL、CALCR、APELIN、IL-2和CSF在第7天特异性表达，而NPR2和HH在第3周特异性表达。 这些细胞信号通路在特定follicle发育阶段发生变化，表明分泌信号可能有助于follicle发育阶段 。由基质细胞分泌的 MK 等分泌因子随着follicle激活持续存在，直至follicle完全生长，这可能代表了基质细胞发送的支持follicle发育的重要信息。分析绘制了follicle发育中的关键信号通路。因此， follicle发育过程中这些细胞群之间的细胞通讯提供了更多关于follicle发育调控网络的信息 。 此外，分析了 ovarian基质细胞的 genetic dynamics 。当基质细胞的转录组与发育阶段一起绘制时，鉴定出 11 个细胞clusters。如前所述，鉴定了每个clusters内的新标记基因，其表达根据发育阶段而变化。 CytoTRACE 分析表明clusters 6、7 和 8 可能是基质细胞的root（关于CytoTrace，大家可以参考文章 10X单细胞轨迹分析（拟时分析）之cytotrace ） 。对已识别clusters的特殊细胞标志物的特征图分析表明，Tcf21 在整个 ovarian基质中的表达最高，Lum 表达主要在cluster 0、1、2、4、5 和 10 中。 Star 和 Cyp17a1 主要在cluster 1 和 9 中表达，Enpep 主要在cluster 3、7 和 8 中表达，干细胞标记物 Aldh1a2 主要在cluster 6 中表达。基因 Lum、Cyp17a1、Enpep和 Aldh1a2 在 10× Visium 切片中可视化，并使用原位杂交 (ISH)、免疫组织化学 (IHC) 或免疫荧光 (IF) 进行验证。 follicle周围基质细胞中的 Lum 表达支持follicle的生长 。 Cyp17a1不仅位于follicle周围的膜细胞中，而且还位于膜外的一些基质细胞中。此外，Enpep 表达与follicle发育有关，并通过 ISH 得到证实。 Aldh1a2主要在 ovarian上皮和 ovarian皮质基质中表达。结果表明， ovarian基质细胞不是指单一的同质细胞群，可以借助 scRNA-seq 和空间转录组学方法进行明确分类 。 为了剖析整个研究期间基质细胞的命运决定，根据基因表达沿伪时间轨迹对它们进行排序 。可以看到第3天、第5天和第7天的大部分细胞处于root状态，而基质细胞在第7天开始分化。这一发现表明第7天是基质细胞分化的时间点。细胞伪时间轨迹显示 5 个基质细胞状态和 2 个分支点。clusters 6 和 10 处于根状态的起点。结合 CytoTRACE 的结果和特定的细胞标志物进行综合分析，发现cluster 6 可能是基质细胞的祖细胞。该cluster的特征在于与生物过程相关的基因的表达，例如“PI3K-Akt 信号通路”、“粘着斑”和“内质网中的蛋白质加工”，这些基因在状态 1 细胞，表明基质细胞具有幼稚的典型功能。编码“脂质和动脉粥样硬化”、“MAPK 信号通路”和“FoxO 信号通路”成员的基因属于状态 3，证实了基质细胞中存在类固醇激素产生。状态 5 由编码参与“亨廷顿病”、“肌萎缩侧索硬化”和“氧化磷酸化”的蛋白质的基因组成，这表明这些基质细胞处于高功能状态。基因Ptn和Gstm6主要表达在状态1，Enpep主要表达在状态5，Star主要表达在状态 3。此外， 鉴定出4个具有不同模式的基因组，4个基因组的特异代表基因，即 Sfrp1、Fhl2、Tmem100 和 Cebpb 。 为了进一步验证 ovarian基质细胞分类，在 E11.5 和 8 周之间的 11 个时间点对follicle和小鼠 ovarian周围的人 ovarian组织进行了分析 。分析中包括具有直径为 2 mm 和 5 mm 的follicle的人类 ovarian组织。根据已知的细胞标志物， ovarian细胞可分为5个细胞亚群，基质细胞可分为6个clusters。ENPEP+ 滤泡周围基质细胞和 CYP17A1+ 类固醇生成基质细胞包围了人类follicle。然后， 在 E11.5 和 1 天之间的六个时间点将数据与 ovarian整合，并确定了 11 种 ovarian细胞类型。在这些细胞类型中，基质细胞和 GC 也占人口的绝大多数。基质细胞分为 10 个cluster，大多数 Aldh1a2+ 基质祖细胞在 E11.5 和伪时间轨迹的根部出现 。 为了更深入地了解上述四组细胞的功能， 使用 SCENIC 进一步研究了基质细胞特异性 TF 的调节子（转录因子（TF））活性 。在follicle发育过程中确定了几个重要的 TF。基于具有默认过滤参数的 5,481 个过滤基因的 51 个调节子活性，调节子活性与发育阶段相匹配，并列出了具有代表性的调节子。如图所示，一系列 TF 显示出更加动态的模式。例如，Maf、Wt1、Gata6 和 Erg1 主要在早期发育阶段活跃。随着follicle发育的继续，Foxo1、Runx1、Stat1 和 Smarca4 似乎主要在follicle成熟的 3 周和 8 周阶段被激活。由于基质细胞在第 7 天开始在细胞伪时间轨迹中分化成不同的命运，专注于这个时间点。 Yy1、Jdp2、Cebpb 和 Maff 主要在第 7 天活跃。Bclaf1 的调节子活性在第 7 天特别关闭。 这些调节子活性模式可能为 ovarian基质细胞命运的确定提供新的见解 。 此外，当将调节子活性与 ovarian基质细胞亚群联系起来时，发现一些 TF 显著代表特定的 ovarian基质细胞亚群 。 Gata6 和 Wt1 主要在没有滤泡周围基质细胞的基质细胞亚群中活跃。 E2f1 和 Ezh2 主要在滤泡周基质细胞中活跃。 Maff 和 Irf1 等 TF 主要在类固醇基质细胞中活跃。 Irx3、Runx1 和 Smad3 主要在基质祖细胞亚群中活跃。 由于 MK 信号在整个follicle发育阶段表达，将 midkine 添加到与包裹在藻酸盐中的follicle共培养中，以进一步证实外向 ovarian基质细胞信号在follicle发育中的作用。 ovarian基质细胞是外向 MK 信号的主要来源，并且GC是主要目标。受体-配体分析表明，Ncl、Sdc4、(Itga6+ Itgb1) 和 Lrp1 是 MK 信号传导的主要贡献者。从第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周对小鼠 ovarian进行了 Mdk ISH 分析。Mdk 主要位于 ovarian基质中，在第 5 天小鼠 ovarian中表达最高。随着follicle的发育，Mdk表达主要发生在生长follicle周围的基质中，而在窦状follicle或黄体周围减少，表明它可能在follicle发育和成熟中起重要作用。然后研究了 Mdk 配体的表达和定位。 ISH和IHC均显示Ncl和Lrp1主要在生长follicle的GCs中表达。接下来，将纯化的 MK 添加到培养基中，以在体外与早期次级follicle共培养。结果表明，midkine 显著促进了follicle生长的增加。这些结果证实了 ovarian基质细胞与follicle的串扰作用促进了follicle的发育。 为了研究基质细胞亚群在follicle发育中的作用，使用 ENPEP-PE 抗体通过流式细胞仪分选获得了follicle周围基质细胞。 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞比 ENPEP- 细胞更像成纤维细胞。免疫荧光分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞表达 ENPEP 和 COL1A1 但不表达 FOXL2。 ENPEP-细胞不表达 ENPEP 或 COL1A1 并且具有高水平的 FOXL2 表达。 qPCR 分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞具有较高水平的 Pdgfa、Enpep 和 Mdk，而较低水平的 Amhr2 和 Foxl2。在细胞培养过程中，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在传代到第三代 (P3) 时不能增殖，这表明 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞可以在体外分化。膜细胞标志物 Star 和 Cyp17a1 的免疫荧光和 qPCR 分析证实，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在长期体外培养中分化为膜样细胞。结果揭示了 ovarian基质细胞类型分类的重要性。这些结果表明， 滤泡周基质细胞不仅具有旁分泌作用，而且还具有分化功能 。 生活很好，有你更好

这是指溶酶体使靶细胞裂解，放出抗原

博凌科为解答：MTT检测时各孔细胞数的均一可比是关键。首先要保证收集细胞的分散混匀，贴壁细胞要消化完全，悬浮集落细胞团块要吹散充分，最好显微镜下观察确定。其次 微量取液操作要规范、稳定，建议选用精密度较高的微量移液器和质地优良的Tip头。至于混匀细胞的场所是选择培养皿还是储液器，抑或其它容器，应该没有很 大的影响，只要方便操作且不影响细胞活力即可灵活选用。额外补充一句，MTT检测结果的影响因素除上面提及的方面外，每孔接种细胞的密度也是保证获取有意 义和正确结果的重要一环，具体的接种细胞密度要根据不同的实验目的和观察效应的差异进行调整、确定。

一般做MTT法检测时都需要将细胞置于96孔板内，无论是悬浮还是贴壁都一样，如果是贴壁自然很简单，如果是悬浮的，那么就需要借用一中比较昂贵的仪器，就是板式离心机，一般实验室不具备这种仪器，如果有的话，可以直接将96孔板置于上面离心后，添加MTT试剂参加反应

细胞活性检测是用于评估细胞在不同条件下的存活状况和生长情况，可以帮助我们了解各种因素对细胞生长和代谢的影响，如D素、生长因子、细胞培养条件等。以下是常用的细胞活性检测方法及其原理：1、MTT法MTT法是一种使用MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑唑-5-基)-2,5-二苯基四氮唑）的间接法，评估细胞代谢和存活状态的变化。MTT是一种无色的水溶性化合物，通过细胞线粒体中的NAD(P)H脱氢酶活性将其还原为有色的紫色甲烷基偶氮苯盐formazan，然后用DMSO或酸性异丙醇提取出甲烷基偶氮苯盐，最后用分光光度计测定其吸光度来评估细胞的代谢活性和存活率。2、CCK-8法CCK-8法（Cell Counting Kit-8）评估细胞代谢和存活状态变化的直接法。CCK-8是一种黄色水溶性试剂，通过细胞线粒体中的脱氢酶活性将其还原为橙色的可溶性产物Formazan，然后测量其吸收光度，以评估细胞的代谢活性和存活率。3、SRB法SRB法是一种使用SRB（Sulforhodamine B）染色的间接法，评估细胞生长和存活状态的变化。SRB是一种红色荧光染料，可以与细胞蛋白质结合，形成一种稳定的复合物，在乙醇或酸性异丙醇中可溶解并定量测定。静止SRB染色的作用是在细胞固定和染色后，将其板洗净，然后用碱性的乙醇洗去非结合SRB，并通过读取吸光度来定量测定结合SRB的含量，从而评估细胞的生长和存活状态。以上提到的三种细胞活性检测方法都是基于外源试剂能够与细胞代谢产物结合形成新产物、反应产物或染色产物的原理，从而间接或直接的评估细胞的活性和生物学特性。每种方法都有其优缺点，实验者应根据实验需求、细胞类型及检测的目的选择合适的方法。

设置用来计算活细胞数的对照孔没有？具体方法：将一定数量活细胞按照梯度稀释加入96孔板（注意设置复孔和空白孔；最好与你的实验细胞同板检测；否则重复性不好）；加入MTT作用后测各孔OD值，做曲线，拟合方程，利用该方程可计算出你的试验孔中活细胞数；接下来的就是常规了。

按照细胞毒药物的要求，mtt法ic50为多少的时候有细胞毒性MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540 或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

MTT法是靠活细胞中NADPH依赖的氧化还原酶作用于底物产生的显色反应。没有荧光。而流式检测一般都是用荧光染料。可以检测细胞膜的完整性。

MTS检测方法是检测细胞增殖、细胞毒性的常用方法。具体方法：细胞生长检测：MTS检测法1．培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。2．取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10％小牛血清）。3．每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。4．每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。5．检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。

博凌科为解答：活细胞中的脱氢酶能将MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物（甲臜，Formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的Formazan量成正比，最后用酶标仪测定OD值。

mtt铺板加药换液吸取旧培养基对细胞有没有影响⒈选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成数量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。⒉药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。⒊ 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。⒋培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。⒌MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。⒍理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。⒎实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。⒏避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

1．制备1 mL细胞悬液。空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。2．加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过夜)，使甲质颗粒充分溶解。3．吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。4．每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。

MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸—异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570nm。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。

MTS法原理：被测物质溶液的颜色或加入显色剂后生成的有色溶液的颜色，颜色深度和物质含量成正比，则根据光被有色溶液吸收的强度，即可测定溶液中物质的含量。跟MTT法区别如下：一、指代不同1、MTT法：利用有色物质对特定波长光的吸收特性来进行定性分析的一种方法。2、MTS法：是一种检测细胞存活和生长的方法。二、原理不同1、MTT法：为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲_（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。2、MTS法：以生成有色化合物的显色反应为基础，比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。三、用途不同1、MTT法：方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。2、MTS法：采用具有分光系统(单色器)及检测器的分光光度计，使测定结果准确、省时，选择性好。参考资料来源：百度百科-比色法参考资料来源：百度百科-MTT法

博凌科为解答：我觉得细胞的浓度并不需要那么精确，关键是接种于每孔的细胞数就大致处于同一水平。比如我做MTT，起初用的细胞浓度为5000/ml，每孔100ul，培养3天观察，发现细胞数太少，各孔OD值反面难于比较。后来我换用 10000/ml，结果就很好。当然细胞数也不能太多，这其实取决于你细胞的生长速度，生长快的细胞，可接种浓度低点。这主要是使细胞增殖率不致受处理因素之外的其他因素影响，比 如接触抑制，营养竞争。总之，做MTT时细胞数应较低，目的就是为了排除其他因素的影响，以使每孔细胞生长情况尽可能地反映出处理因素的影响。细胞接种的浓度和你的实验目的、要求、细胞种类、处理因素的特殊要求都有关系。没有简单的，每孔接种多少的一个标准。当然，可以用楼上建议的浓度开 始摸索。同时，注意肿瘤细胞核正常细胞的生长数度也不一样，前者生长快，后者慢，细胞数的量也有讲究。到底多少合适，得根据你的实验具体要求来摸索。我做 b16转染时，因为脂质体要求细胞融合度为30%-50%，曾经没孔接种过300-500个细胞，效果非常好，

一般做MTT法检测时都需要将细胞置于96孔板内,无论是悬浮还是贴壁都一样,如果是贴壁自然很简单,如果是悬浮的,那么就需要借用一中比较昂贵的仪器,就是板式离心机,一般实验室不具备这种仪器,如果有的话,可以直接将96孔板置于上面离心后,添加MTT试剂参加反应