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Microsoft应用程序兼容性工具包5.6的数据库http://support.microsoft.com/kb/2533953http://www.microsoft.com/download/en/details.aspx?id=7352

使用别的浏览器进入，比如火狐之类的，然后安装该浏览器的元素查看插件，进入该网站后点击该插件图标，选中你所需要的视频文件后保存就OK

两者不同lineofcredit是你一个月可以在一张信用卡上使用的额度，可能是20,000元而creditlimit可能是你一天允许花的最高限额，可能一次不能超过750元

cry to me，以前我也很喜欢这首歌，睡觉起床必来的一首歌，百听不腻，也不知道为什么感触特深

通常QPCR实验中CT值的异常主要有以下几种情况： 一、扩增曲线正常，CT值偏大或偏小从CT值表达公式中我们可以看出初始模板的质量和扩增效率，会直接影响到CT值的大小。 如果扩增起始模板量浓度高或引物设计不合适那么所用的循环数就会小，即出现Ct值过小；反之，起始模板量浓度过低，Ct值会偏大。 PCR扩增效率与 CT 值也是成反比关系，扩增效率高则CT值小，扩增效率低则需要要用到的循环数增加所对应的CT值也会偏高。另外，合理的引物设计，防污染试剂的应用也会影响到CT值的大小。二、 有扩增曲线，但却没有CT值，CT值显示状态为Undetermined这种情况下你通常也会发现由于阀值位置不

同为参考物质。一般而言，检验工作中使用的标准品属应用标准。将符合质量标准的纯品使用称量法和容量法配制成溶液。用决定性方法反复测定，结果在规定的范围内属合格。而待测物质则是还未精确测量的物质。

随着学科的发展，目前许多研究都涉及高通量数据分析 (high throughput data analysis)。比较常见的是测序结果分析，例如RNA-seq、CHIP等等。 众所周知，数据分析是高通量测序应用于生物研究最关键的步骤，分析不好，得到的海量数据无异于一堆垃。

可以尝试重启仪器。如果重启失败可以联系工程师。即时聚合酶链锁反应（Real-time polymerase Chain Reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/QPCR/qrt-PCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法。定量即时PCR及定量反转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）已被众多科学家采用，因为其侦测范围广、灵敏度高、准确、专一及快速。qPCR的发展因为侦测感染病患的病毒或细菌量、癌症监测、诊断个别基因差异的用药反应等应用而大幅提高。qPCR的方法是基于侦测目标物在反应前及PCR后产物的量化关系。相对于终端PCR方式（end-point PCR，传统的PCR配合凝胶电泳，在反应后侦测）qPCR有许多优点。其结果可以较快取得且稳定，因为是采用非常敏感的化学萤光，而且不需要在PCR反应后的侦测步骤。此外，因为反应后不需打开管子而减少了操作污染。qPCR分析亦适于更具挑战性的应用，如多重侦测与高通量分析。

不同小鼠qpcr结果怎么趋势都不一样那怎么看结果曲线，是微分几何学研究的主要对象之一。直观上，曲线可看成空间质点运动的轨迹。微分几何就是利用微积分来研究几何的学科。为了能够应用微积分的知识，我们不能考虑一切曲线，甚至不能考虑连续曲线，因为连续不一定可微。这就要我们考虑可微曲线。但是可微曲线也是不太好的，因为可能存在某些曲线，在某点切线的方向不是确定的，这就使得我们无法从切线开始入手，这就需要我们来研究导数处处不为零的这一类曲线，我们称它们为正则曲线。正则曲线才是经典曲线论的主要研究对象。

一般1-2天出结果。定量逆转录PCR是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

qpcr仪关闭之前数据找回，方法如下：1、要想恢复未保存的qpcr仪器的文档，首先要做的事情就是开启qpcr仪器的文件自动保存文档功能，且将保存文档时间间隔设置小一些，这样就可以最大化避免文档内容的丢失。具体操作方法：点击“Office按钮”，从其扩展菜单中选择“qpcr仪器的文件选项”。2、在打开的“qpcr仪器的文件选项”窗口中，切换到“保存”选项卡，勾选“保存自动恢复信息时间间隔”项，同时设置时间间隔，在此小编设置为“3分钟”，可以根据实际情况来进行设置。3、设置“自动恢复文档位置”，建议使用自定义位置，这样方便因非法操作或断电时及时恢复文件。点击“浏览”按钮就可以定位到自定义位置。点击“确定”完成设置。4、以后当编辑文档时，必须确保至少保存一次，原因在于通过首次保存可以确定文档名称，这样就为qpcr仪器的文件的恢复操作坚定了基础。5、最后来测试一下：创建一个新的qpcr仪器的文件，输入部分内容，点击“保存”或“另存为”将该文档进行保存。6、接下来再输入一些内容，并等待“时间间隔”所设置的最小时间，即等待3分钟以上。7、然后模拟断电或程序非法操作而退出：右击任务栏，选择“启用任务管理器”。8、在打开的“Windows任务管理器”窗口中，切换至“应用程序”选项卡，选中当前正常编辑的qpcr仪器的文件，点击“任务结束”按钮。9、然后再次打开之前保存的文档，则会自动弹出“文档恢复”窗口，点击要恢复的文档，就会发现丢失的内容被找回来啦。10、当然，也可以通过之前所设置的“Excel文件自动恢复”目录中恢复未保存的文档。找到要恢复的文档，直接使用qpcr仪器程序打开即可。

数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合医院操作等优点，在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床应用方面具有显著优势。而qPCR适用于较常规的临床分子诊断项目。瞬渺光电为您的PCR仪器光路部分提供更低噪声稳定型激光，为仪器带来更好的表现，详询payne@rayscience.com

1-2天。定量逆转录PCR是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法，所需要的时间会长一些能达到1~2天，确保实验效果更加准确。

显然用荧光定量PCR（qPCR）。mRNA荧光差异显示技术是在qPCR技术广泛应用之前，比较mRNA水平上基因表达差异的一种方法，可以说已经过时了，尤其是在你有条件做qPCR的情况下。mRNA荧光差异显示技术的前几步就是用Oligo dT做总mRNA逆转录，转成cDNA后，用特异性带荧光标记的引物扩增目标DNA，测定表达水平。其实qPCR的原理与之基本一致，只是在测量荧光表达时用机器定量测定，更加准确。

提取三次，那个是生物学重复，甚至应该全程做三遍。提取一次检测三次那个叫技术重复 样本的采集可能是实验变异的第一个来源，特别是RNA实验，因为mRNA的特性易被样本的采集和处理而不稳定。建议新鲜组织可以保存在冰块中，这对RNA的质量和浓度没有多大的影响，但是虽然这种保存方法对一些mRNA和组织是有效的，它也不可能普遍应用。因此在样本采集时应当谨慎。由此应详细记录组织样本的采集以及是否及时处理等信息。如果样本没有及时处理，必须记录是如何保存的，以及在什么情况下保存了多长时间。样本的简要说明也是必不可少的。例如一个肿瘤样本的显微镜镜检可以发现样本由肿瘤细胞组成的比例，这些信息也需要报道。核酸的提取是第二个关键步骤。提取效率取决于足够的同质化，样本的类型(如原位组织和培养组织)，样本密度，生理状态(如健康、癌症或者坏死)，基因复杂性，以及处理量。因此必须记录核酸取方法的细节，以及检测核酸浓度和评估质量的方法。这些细节对从新鲜冰冻显微切割标本中提取RNA特别重要，因为组织提取过程对RNA的数量和质量影响很大。

原理都不一样，一代测序是双脱氧末端测序，qpcr是荧光探针或染料检测的，两者都会进行扩增但是前者是扩增出不同片段进行电泳的，同时两者都可以检测出突变，缺失

方法/步骤11、百度搜索下载免费的Bio-Rad CFX Manger3.1软件，下载完毕后安装到你电脑上。22、在电脑上点开Bio-rad-2软件，会出现一系列的文件夹和应用程序扩展以及应用程序之类的，专门找到应用程序里面的BioRadCFXManager。33、点击步骤二中的应用程序。程序开启的速度有点慢，请耐心等待。关掉弹出来的无关窗口，点击File，下拉选择Open，选择横向的Data File，点击Data File，弹出你要选择加进去的QPCR数据文件。44、完成步骤三后会弹出你的QPCR曲线结果图。开始对结果图进行分析。首先点击Quantification那栏，看看QPCR的特征曲线跑得怎么样。用鼠标随意点击上面的一条绿色曲线，就出现相对应的哪个孔的Cq值。55、开始对曲线进行分析。这里的曲线多数分为两大类，分别代表了两种不同的引物的扩增曲线。曲线中另外出现了两条水平的线，一条在0刻度线处，代表该孔未加染料（QPCR mix）；而另一个孔在0-100之间，代表该孔未加模板cDNA，导致无法起峰进入平台期。这两条曲线去掉，不做数据分析。另外跟这两大群主峰的曲线分散比较大的杂曲线，也作为误差较大曲线，数据分析的时候弃掉不用。66、点击Melt Curve，一般有几个引物便会出现几个特征性的主峰。并且大部分曲线都会簇拥在它们的主峰里面。将数据导出来分析要返回到Quantification，在Cq值下面右击，出现Export to excel，点击，即可保存为Excel表格，分为07和03版本。

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特 异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。 3. 仪器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G. 反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。 需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不 同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！五、Real-time qPCR数据分析1. Real-time qPCR常见参数基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold）自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。 2.影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。 PCR反应的效率PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。 3. 如何评估实时定量PCR反应的效果PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。常见问题1. 无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 3. 标准曲线线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。6. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性 如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？ 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解 荧光定量PCR问题汇总1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？ 　　　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？　 　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以 分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一 起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下：　　· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。　　· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。　　· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。　　· 单击碎片整理(Defragment)。　　· 当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。　　· 在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。　　· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4. 何时执行windows service pack更新？　 　不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5. 应该备份哪些数据？　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。　　空间：易于操作，安全。7. 怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。　　吹打数次。　　将废液吸入废液杯中。　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。 　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。8. 什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？ 　 　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收 集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数 据中扣除背景信号。 　　因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9. 什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后 每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样 品中的荧光染料种类和信号强度。　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封膜？　　当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置？　 　使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后 逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12. 绝对定量与相对定量有什么区别？　　绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。　　举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。 　　绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 　 　相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为 简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 　　 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。 　　绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。　　相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。13. 定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？ 　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。 　 　首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的 荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。 　 　其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。 　　第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。14. 标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？ 　　假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：15.什么是CT值比较法？数据怎么处理？　　CT值与起始DNA浓度的对数成反比：　 　如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。　　　　　16. 每个反应管中可以加入多少种探针？ 　 每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。　 　首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制 的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为 例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。　 　其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不 重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。　 　第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种 荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样 做），还可以再多一种荧光用于标记探针。　　第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。　 　最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加 入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花 费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。 　　在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。17. 等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正？不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。　　由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。 　　这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。18. 内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的 PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它 们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

1、百度搜索下载的Bio-Rad CFX Manger3.1软件，下载完毕后安装到你电脑上。2、在电脑上点开Bio-rad-2软件，会出现一系列的文件夹和应用程序扩展以及应用程序之类的，专门找到应用程序里面的BioRadCFXManager。3、点击步骤二中的应用程序。程序开启的速度有点慢，请耐心等待。关掉弹出来的无关窗口，点击File，下拉选择Open，选择横向的Data File，点击Data File，弹出你要选择加进去的QPCR数据文件。4、完成步骤三后会弹出你的QPCR曲线结果图。开始对结果图进行分析。首先点击Quantification那栏，看看QPCR的特征曲线跑得怎么样。用鼠标随意点击上面的一条绿色曲线，就出现相对应的哪个孔的Cq值。5、开始对曲线进行分析。这里的曲线多数分为两大类，分别代表了两种不同的引物的扩增曲线。曲线中另外出现了两条水平的线，一条在0刻度线处，代表该孔未加染料（QPCRmix）；而另一个孔在0-100之间，代表该孔未加模板cDNA，导致无法起峰进入平台期。这两条曲线去掉，不做数据分析。另外跟这两大群主峰的曲线分散比较大的杂曲线，也作为误差较大曲线，数据分析的时候弃掉不用。6、点击MeltCurve，一般有几个引物便会出现几个特征性的主峰。并且大部分曲线都会簇拥在它们的主峰里面。将数据导出来分析要返回到Quantification，在Cq值下面右击，出现Export to excel，点击，即可保存为Excel表格，分为07和03版本。

溶解曲线的意思是：当温度高于扩增产物的TM值时，双链产物变单链，荧光值因为这样的变化而产生变化，根据这一原理，你推算你的体系是是否会在温度变化时产生荧光值的变化，比如你用的是TAQMAN探针，taqman探针产生荧光变化的原理是探针被外

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溶解曲线的意思是：当温度高于扩增产物的TM值时，双链产物变单链，荧光值因为这样的变化而产生变化，根据这一原理，你推算你的体系是是否会在温度变化时产生荧光值的变化，比如你用的是TAQMAN探针，taqman探针产生荧光变化的原理是探针被外切酶活性的TAQ酶剪切断而产生的，那么在只有温度变化的情况下，是没有荧光值变化的，自然就没有溶解曲线了。但是假如你用的分子信标探针或者sybgreen燃料，情况就不同了。

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：1. MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4. 所有成分加完后，离心去除气泡。5. 每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特 异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。 3. 仪器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（program setup）。我们以 ABI StepOne为例，详细看一下反应设置：A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为逗BioTeke地，进行逗定量地实验。B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G. 反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。 需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不 同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择逗none地。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！五、Real-time qPCR数据分析1. Real-time qPCR常见参数基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号 同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线 阈值（threshold）自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。 同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。 Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。 2.影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。 PCR反应的效率PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。 3. 如何评估实时定量PCR反应的效果PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。常见问题1. 无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 3. 标准曲线线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。6. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断看判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性 如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常看比如逗S地型曲线看 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解 荧光定量PCR问题汇总1. 定量PCR仪的开关机顺序是怎样的看　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2. 哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用看有何需要注意的地方看 　　　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3. 为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理看怎样整理看　 　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以 分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一 起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下：　　· 在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(My computer)。　　· 在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。　　· 在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。　　· 单击碎片整理(Defragment)。　　· 当显示逗碎片整理完毕地对话框时，单击（确定）。　　· 在逗本地磁盘属性地对话框中，单击（确定）。　　· 为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4. 何时执行windows service pack更新看　 　不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。新版本的Microsoft Windows操作系统有可能与SDS 软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装service pack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS 软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5. 应该备份哪些数据看　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行看　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。　　空间：易于操作，安全。7. 怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染看怎样清除污染看　　一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。　　另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。　　吹打数次。　　将废液吸入废液杯中。　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。 　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。8. 什么是背景校正看多长时间执行一次背景校正看 　 　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收 集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数 据中扣除背景信号。 　　因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9. 什么是纯荧光校正看多长时间校正一次看　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器逗认识地各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后 每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样 品中的荧光染料种类和信号强度。　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封膜看　　当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置看　 　使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后 逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12. 绝对定量与相对定量有什么区别看　　绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。　　举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。 　　绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 　 　相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为 简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 　　 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。 　　绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。　　相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。13. 定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理看 　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。 　 　首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的 荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。 　 　其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18S RNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。 　　第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。14. 标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理看 　　假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：15.什么是CT值比较法看数据怎么处理看　　CT值与起始DNA浓度的对数成反比：　 　如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。　　　　　16. 每个反应管中可以加入多少种探针看 　 每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。　 　首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制 的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为 例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。　 　其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不 重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。　 　第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种 荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqMan MGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样 做），还可以再多一种荧光用于标记探针。　　第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。　 　最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加 入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花 费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。 　　在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。17. 等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正看不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。　　由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。 　　这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。18. 内标法和外标法哪种数据更精密看是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的 PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它 们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

1、百度搜索下载免费的Bio-Rad CFX Manger3.1软件，下载完毕后安装到你电脑上。2、在电脑上点开Bio-rad-2软件，会出现一系列的文件夹和应用程序扩展以及应用程序之类的，专门找到应用程序里面的BioRadCFXManager。3、点击步骤二中的应用程序。程序开启的速度有点慢，请耐心等待。关掉弹出来的无关窗口，点击File，下拉选择Open，选择横向的Data File，点击Data File，弹出你要选择加进去的QPCR数据文件。4、完成步骤三后会弹出你的QPCR曲线结果图。开始对结果图进行分析。首先点击Quantification那栏，看看QPCR的特征曲线跑得怎么样。用鼠标随意点击上面的一条绿色曲线，就出现相对应的哪个孔的Cq值。5、开始对曲线进行分析。这里的曲线多数分为两大类，分别代表了两种不同的引物的扩增曲线。曲线中另外出现了两条水平的线，一条在0刻度线处，代表该孔未加染料（QPCRmix）；而另一个孔在0-100之间，代表该孔未加模板cDNA，导致无法起峰进入平台期。这两条曲线去掉，不做数据分析。另外跟这两大群主峰的曲线分散比较大的杂曲线，也作为误差较大曲线，数据分析的时候弃掉不用。6、点击MeltCurve，一般有几个引物便会出现几个特征性的主峰。并且大部分曲线都会簇拥在它们的主峰里面。将数据导出来分析要返回到Quantification，在Cq值下面右击，出现Exportto excel，点击，即可保存为Excel表格，分为07和03版本。

一般来讲，进行real-timeqPCRMasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-timeqPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：1.MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2.的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。3.每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4.所有成分加完后，离心去除气泡。5.每个样品至少3个平行孔。参比或者校正染料（referencedye，passivedye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。通常来讲，real-timeqPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样，要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增。而溶解程序，仪器都有默认设置，或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候，进行荧光信号的收集。3.仪器设置所有仪器的操作都基本一致。设置的时候包括反应板设置（platesetup）和程序设置（programsetup）。我们以ABIStepOne为例，详细看一下反应设置：A.首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”，进行“定量”实验。B.实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBRGreen方法，Fast程序，以cDNA为模板进行。C.目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D.样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E.对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F.反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G.反应体系的设置：A-G这五个步骤简单设置好，可以保存，修改反应程序或者立刻进行反应。需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料，默认的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是单独分开。要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。BioTeke的MasterMix里没有参比染料，所以选择“none”。设置好之后，就可以把配置好的PCR管放进仪器，点击RUN！五、Real-timeqPCR数据分析1.Real-timeqPCR常见参数基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值（threshold）自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。Rn（Normalizedreporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。2.影响Ct值的关键因素模板浓度模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。PCR反应的效率PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。3.如何评估实时定量PCR反应的效果PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。常见问题1.无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2.Ct值出现过晚（Ct>38）扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。3.标准曲线线性关系不佳加样存在误差:使得标准品不呈梯度。标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4.负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5.溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。6.扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8.扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解荧光定量PCR问题汇总1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？　　按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。　　开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。　　关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？　　　　定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2ml光学八联反应管配合光学膜，0.2ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？　　当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。碎片整理的方法如下：　　·在Windows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(Mycomputer)。　　·在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。　　·在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragmentnow)。　　·单击碎片整理(Defragment)。　　·当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。　　·在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。　　·为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。4.何时执行windowsservicepack更新？　　不要执行该操作。除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR仪的计算机的操作系统。新版本的MicrosoftWindows操作系统有可能与SDS软件存在冲突，并导致仪器不能正常运行。如果您希望安装servicepack（更新包）以更新操作系统，应查看随SDS软件提供的版本说明，避免兼容性问题。5.应该备份哪些数据？　　应该定期备份您的实验数据，备份频率推荐每周一次，用光盘刻录。同时您也应该备份定量PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验数据，这些文件所在的目录是C:/Appliedbiosystems/SDSDocument。下图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？　　良好的实验室环境有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面：　　电源：推荐配备合适的UPS或稳压器。　　通风：仪器的通风应该没有阻挡。　　温度：推荐实验室配备空调，温度应该控制在10-30°C之间。　　湿度：20-80%；对于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。　　空间：易于操作，安全。7.怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？　　一个法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。　　另外一种法是在不放任何物品到样本块上的前提下，执行ROI的校正，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：　　用移液器吸取少量乙醇并滴入每个污染的反应孔中。　　吹打数次。　　将废液吸入废液杯中。　　重复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。　　确认反应孔中的残留液体蒸发完。8.什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？　　背景校正程序测量定量PCR仪所使用的反应管和水的空白荧光强度。在运行校正程序期间，定量PCR仪在10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，信号收集的温度为60°C。随后，SDS软件计算所收集到的荧光强度的平均值，提取结果并保存到校正文件中。软件在今后的分析中将自动调用此校正文件，从实验数据中扣除背景信号。　　因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9.什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？　纯荧光校正是测定各种纯荧光染料标准品的波长和信号强度，通俗地说是让仪器“认识”各种荧光染料。软件收集并储存各种纯荧光染料标准品的荧光信息。以后每次定量实验运行过程中，SDS软件收集样品的原始光谱信号，并将此原始光谱与纯荧光文件中的数据进行比较，精确扣除不同染料的信号重叠部分，从而确定样品中的荧光染料种类和信号强度。　　推荐每半年进行一次纯荧光校正。在运行光谱校正之前，请先进行背景校正和ROI校正。10.96孔板怎样封膜？　　当使用96孔板做实验的时候，推荐使用光学膜代替盖子来密封反应孔。正确的封膜方法是：先沿着96孔板的纵向压膜，然后横向，最后沿着板的边缘按压使之密封。11.使用单管或8连管做实验时，在样品加热块上应该怎样安排放置？　　使用单管或8连管做实验，并且样本数量不多的时候，建议在样品加热块(TRAY)上对称地安放样品，最好是纵向放置，并且优先放在第6列或第7列，然后逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反应管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12.绝对定量与相对定量有什么区别？　　绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。　　举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。　　绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。　　相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。　　CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是。　　绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。　　相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。13.定量PCR基因表达的实验数据应该如何处理？　　总的来说，有三个层次的校正是必须要做的。　　首先，参比信号校正。试剂中必须包含固定浓度的ROX，这样由于反应总体积的差异、所在孔的位置不同、试管壁的厚度差异、管盖透光性能的差异等所引起的荧光信号波动都能够被扣除，使数据真正反映PCR进程。ROX校正能够极大地改进定量的精确度，提高重复管之间的数据重现性。　　其次，内对照校正。实验中加入样品基本上都是以体积为单位的，但是同样体积的不同样品很可能来自不同数目的细胞，所以将实验结果校正到每个细胞的含量是必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同时定量一个内对照基因（如18SRNA基因），然后IL-2/18S。内对照校正使不同样品的实验数据可以相互比较。　　第三，计算相对于基准样品(Calibrator)的相对基因含量。比如研究处理和未处理的、0小时和6小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。14.标准曲线法相对定量的数据应该怎么处理？　　假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用的内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定结果都是总RNA的pg数，数据的处理方法见下表：15.什么是CT值比较法？数据怎么处理？　　CT值与起始DNA浓度的对数成反比：　　如果(1)不同管之间的PCR反应效率相同；(2)这些PCR的反应效率接近100%，可以从上面的公式推出相对含量(X01/X02)=2-ΔΔCT。假设实验的目标是研究药物处理后0、24、48小时IL-2基因在某种组织中的表达量的变化，所用内对照是18SRNA基因。IL-2和18SRNA的测定结果都是CT值，而没有通过标准曲线测定总RNA的pg数。　　　　　16.每个反应管中可以加入多少种探针？　每个反应管中可以加入的探针数目，取决于仪器、软件、试剂和实验设计等几个方面。　　首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，全波长检测的定量PCR仪如激光管-CCD类型对于探针的数量实际上是没有限制的。如果信号的采集要通过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，增加探针需要增加或改变滤色片。改动仪器的结构通常很困难。以AB公司的仪器为例，7900和7700是激光-全波长检测的，7000、7300是4色滤色片的，7500是5色滤色片的。　　其次是化学上的可能性。不同的荧光基团要组合到一起，在同一反应管内使用，必须其激发波长既相对靠近又不能靠得太近，既保证信号激发的效率又保证信号不重叠干扰，能够区分清楚。现已发现的荧光基团种类有限，满足这样条件的分子组合更少。目前的最佳组合只能达到每组4到5种荧光的水平。　　第三是实验方案的设计和选用的探针类型。定量PCR实验必须使用ROX校正荧光，占去一种荧光；TaqMan探针的淬灭基团(TAMRA)也要占用一种荧光，对于4色检测的仪器来说，只剩下2种荧光可以标记探针，对于5色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用TaqManMGB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的，比之TaqMan探针就可以多1种荧光用于标记探针。如果实验要求不高，不做ROX校正（AB公司不推荐这样做），还可以再多一种荧光用于标记探针。　　第四是研究应用本身的要求。如果研究SNP和基因突变，因为绝大多数人类基因是2态的，只存在两种等位基因，2条探针已经足够。如果研究基因表达，通常是两两比较居多，比如处理比未处理，正常比异常等，加上一个内对照，3色也就足够了。　　最后是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高数据精确度，二是节省反应成本。同时测定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5种探针，就要同时加入8-10条引物。在引物设计的时候要考虑到尽量减少这些引物之间的竞争和抑制等多种干扰，平衡各对引物之间的PCR效率。虽然这是可以做到的，但是要花费大量时间、人力和物力来筛选最佳引物组合、优化反应条件。如果实验规模不大，在总体上可能反而不合算。　　在实际应用中，不是单纯追求加入的探针越多越好，而是追求总体效益的最优化。比较切合实际的是2到3重反应，引物和探针的设计不太困难，反应条件的优化也不太麻烦，同时降低了成本。17.等位基因鉴定实验（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不进行ROX荧光校正？不，等位基因鉴定实验也要进行ROX荧光归一，以保证实验结果的精密可靠。　　由于试剂加样操作的误差、离心管热量传递的误差、离心管盖透光性能的误差等偶然因素是不可避免的，必然导致荧光激发效率的差异，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，相互之间才可以比较并保证重现性。　　这种校正是通过在反应缓冲液中添加ROX校正荧光来实现的。ROX在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的高低变化只与上述物理方面变化的总体效应有关。将报告荧光的信号除以ROX荧光的信号，就能够消除所有这些物理因素所引起的数据波动。18.内标法和外标法哪种数据更精密？是同样可靠的。内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。两相比较，内标法与外标法的数据精确度是一样的。

q PCR内参做3个。QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction简称PCR)原理凭借敏感、特异、快速的特点荣获93年诺贝尔化学奖。因其在病原体检测方面的独特优势，因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流，至今仍处于学术和应用前沿。

qPCR数据处理方法为△△Ct法原理【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。1、先来了解一下什么是Ct值？阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline）。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

RT-qPCR简介 定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。 RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1、表1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。 RT-qPCR逆转录过程 在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用 1 。 在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物（图2，表2）。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。 逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。 RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解（图3）。 step1：如果 RNA 模板具有较高的二级结构建议操作该步骤。 step2：该步骤建议用于引物的延伸。 step3：逆转录酶以 mRNA 为模板合成 cDNA 链。 step4：该步骤可阻止活性逆转录酶带来的 qPCR 抑制。 用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。 如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。 一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中，以检测 DNA 污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR 扩增，则极有可能来自 DNA 的污染。 图 4.RT-qPCR 中 qPCR 步骤的引物设计。1）如果一个引物被设计为跨越外显子-内含子边界，则可能造成污染的基因组 DNA 将不会被扩增，其原因是引物不能退火至该基因组 DNA 模板。相反，cDNA 不含任何内含子，能够有效被引物识别并扩增。2）当引物侧接一个长的内含子（例如1 kb），扩增反应将不会发生，因为短的延伸时间仅够用于扩增短的 cDNA，却不足以扩增基因组靶基因

qpcr原理介绍如下：qPCR原理是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。qPCR技术广泛应用于生物医药食品等行业，运用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等。具体的应用环境：1、动物疾病检测禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。2、食品安全食原微生物、食品过敏原、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。3、科学研究医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

qpcr原理：通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。qpcr应用于大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。1、qpcr是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。2、Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。逆转录PCR，或者称反转录PCR，是聚合酶链式反应的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进行DNA复制。由一条RNA单链转录为互补DNA称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶来完成。3、由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。数字PCR即DigitalPCR，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接输出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

上世纪八十年代的化学家发明了PCR，如今DNA扩增俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR。qPCR和dPCR，它们之间都有什么区别呢？ 目前的PCR方法主要可以分为三类： PCR、qPCR和dPCR 。 PCR是最原始、最简单的PCR方法，如今仍在被我们广泛使用。使用者只能在PCR反应结束之后，通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。PCR本身是无法定量的，因为我们只能获得反应结束的样品。通过凝胶电泳只能看出扩增质量、不同样品目的片段分子量的相对大小（通过电泳移动的距离，产生不同距离的原因可能是不同片段的扩增速度有别使得单一片段有长短，也可能与碱基含量有关）。无法根据条带颜色深浅得到量值。 qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针（比如TaqMan），人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。该方法主要通过样品的Ct值（Cycle Threshold，即扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数）与该样品起始拷贝数的对数存在线性关系配合标准曲线来计算样品反应前目标序列的含量的。 dPCR的原理并不复杂。首先，dPCR把反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布。然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。 主要参考文献： [1] 詹成,燕丽,王琳,金玉麟,陈力,时雨,王群.数字PCR技术的发展和应用[J].复旦学报(医学版),2015,42(06):786-789.

二者系统组成不同 荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行“定量分析”的方法。记住，实时荧光定量是定量分析。二者系统组成不同，荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。二者原理不同，荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通OCR通过检测插入DNA中核算染料的量来测定PCR最终产物量。二者反应要求不同，荧光定量PCR对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp，普通PCR可以扩增长点的片段。二者应用不同，荧光定量PCR主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，反之不行。二者测量成本不同，定量PCR仪价格较为昂贵，普通的基因扩增仪（PCR仪）只能够定性地分析是否存在目标片段。但是价格要低很多，而且运行成本也要低很多。实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。

溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解.这个一般是用SYBY Green作为荧光染料的时候需要做的工作！我们实验室用BIOGHC Elitefast SYBR Kit检测DNA,熔解曲线是为了验证扩增产物特异性的，要是熔解曲线是单峰说明产物只有一条，结果较好；要是双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，有可能你的引物设计有问题。

一楼的~real-time PCR不就是RT-PCR吗？！实时定量PCR

rt-qpcr全称为实时荧光定量（Real Time Quantitative）RT-qPCR属于第二代PCR技术，与常规的PCR技术相比，RT-qPCR技术可对DNA起始模板进行定量，同时可以对整个扩增反应进行实时监控。该方法中，总RNA或者信使RNA首先通过逆转录酶转录互补DNA，随后cDNA为模板进行qPCR反应，RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、病原体检测和疾病研究。以上就是对于rt-qpcr的一些基本情况，希望能够帮助到你！加油！

PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：PCR的技术的主要步骤：1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。2、引物设计的基本原则1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。3、引物内部不应出现互补序列。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。扩展资料PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化，PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。参考资料：百度百科-PCR技术

做完转录组分析之后，一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法，他的计算方法有很多，常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法，ΔCt法，2 -ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的2 -ΔΔCt法(Livak法): 该部分引用自下方参考链接1 qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。 Ct值 计算 -ΔΔCt ：内参基因分为对照组和处理组内参基因 单个样本三个技术重复，检验不同的目的基因扩增效率 结果 ： IL-1B 和INOS基因相比NC组而言，其含量越多

你好啊，他们之间的区别基本上不大没有什么区别。

荧光定量PCR原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针（BIOGHC Elitefast SYBR Kit）和荧光染料（BIOGHSC Super Probe Kit）

qPCR这项技术，被广泛用于生物学的研究，只有有以下用途： qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下， 还可以分为 绝对定量 和 相对定量 。 好的， 那么一般情况下， 我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。 qPCR和PCR一看名字就知道很像， q 就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。。（为我的废话鼓掌） 其实，说到底，qPCR就是通过荧光染料或者荧光探针来表征PCR产物的量，进而推断出PCR前，样本的初始核酸量。 具体原理是，对于不同的样本和基因，比较到达一定荧光强度所需要的循环数， 如果你的样本中DNA1的量 大于 DNA2的量，那么理论上， DNA1比DNA2需要更少次数的PCR扩增就可以达到某一个阈值. 如果对于详细原理有什么执念的同学可以自行百度，必应，谷歌。。。 在实际实验过程中， 我们的实验没那么简单 一个仿真例子： 那么我们一般这样做，我会有处理和未处理的细胞，我们想比较这两种细胞geneA表达量的差异，我们在提取细胞的RNA并定量后反转成cDNA后，进行qPCR， 获得geneA和某一个内参基因（如GAPDH）的CT值。内参基因GAPDH在这里起到一个矫正的效果来去除不同的样品间 RNA产量 ， RNA质量 以及 逆转录效率 上的差别。 最最最常用的qPCR相对定量的方法是 ΔΔCT 法 （读作：delta delta CT） 公式如下 即 先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异 ，而我们的表达量的差异就可以表征为 虽然大多数qPCR设备都配有很完备的分析软件， 但是 。。。。。 这些软件的图可能不适合直接放文章，或者， 咳咳，很丑,你想自己修改之类的 而他们一般都不太提供最终计算结果，只提供CT值，那么这个就很让人头大了。 于是乎 秉承着 自己动手丰衣足食 一直折腾一直爽 的传统美德，我写了一个小小的工具，方便大家计算最终的相对表达量 该工具基于微软爸爸的EXCEL和VBA，不限样本数量，基因数量及每组实验的平行个数（如果你有三个复孔，其中一个如果CT和其他两个差别很大，你可以删除该孔，有些组3个复孔，有些2个，不影响程序运行） 在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序迎来了V2.0版本，主要增加了自动添加误差线的功能。 大家感受一下， 一键出图 的魅力，喜欢的同学记得点赞，转发哦, 获取链接在文末 获得相对表达量值之后呢，你可以使用origin或者graphpad等工具作图，读者可以查看我往期关于origin的文章哦 文章直通车>>> origin科研作图 此工具如有任何问题或者你们有什么建议或者链接失效等情况，请于公众号“肖恩札记”留言

那么进入正题吧！ 今天我们讲讲假设检验这个东西，并且会以 qPCR数据处理 为例子，应用假设检验，获得传说中小于0.05就很了不起就P值。 文末还有大大的彩蛋哦！！！ 假设检验这个东西，我们顾名思义，就是 检验 某一个 假设 ，所以，这就很自然地引出两个重点，欸对，两个重点就是： 我们可以这么理解student t检验这个东西： 一般来说，我们的假设是， A，B两组没有差异 ，然后计算在A，B没有差异的情况下，出现我们观察到的数据的概率。 如果该概率<0.05 ,那么我们就说，这事发生的概率太低了，这个假设不靠谱，我们就 否定原有的假设 ，进而相信A组数据和B组数据在统计上有显著性差异。 这里有两个统计学的术语： 除了T检验，还有别的检验，不同的检验都有对应的 假设 和 检验 方法，比如F-检验，卡方检验，秩和检验等，适用于不同的情况，有不同的目的，使用前要搞清楚。 最常用的就是T检验，我们已经知道了他的整体逻辑了，但是我们还不清楚，他如何计算的，理解了计算过程，可以让我们更好地理解和解读p值，不去错误地使用p值，不迷信p值。 在理解计算原理之前，我们举个栗子，思考一下别人的人生： 老张闭上眼睛，认真思考着以上问题（读者可以跟着他一起思考，助他一臂之力） 没想到老张是个被苹果耽误了的数学家。他花了一周画了两张图。 老张点了根烟，叹息道， 这一切都是抽样造成的 ，如果我能收集世上所有A苹果和B苹果，就可以求出准确的均值，我就知道哪个苹果大了。但是我做不到，做不到就只能抽样。 抽样只能近似真实的均值，但总存在误差。 比如上面的两张图，蓝色是抽样的A苹果不同重量的频数，红色是B苹果。左右两张图，同样是均值差10g（均值以竖直直线表示），但是左图中， 红色曲线下面积与蓝色曲线下面积很少重叠 ，也就是说，红色整体上 确实大于 蓝色。而右边的图，虽然红色的均值大于蓝色10g，但是 这两条曲线基本重合 ，这次抽样B比A大10g，很有可能是 误差 。下次再试一次，可能A就比B大了。 老张猛吸一口烟，转念又想，即使是右图的情况，如果我是统计了咱们镇 所有的AB苹果 ，得出这样的结果，是不是还是可以说B比A平均大10g呢，这总比我统计100个苹果来的准吧！ 老张熄灭了手头的烟，缓缓的说： 面对浩瀚无垠的数学宇宙，张三开始了他的统计之旅： 他提出了以下思路： 于是乎，老张不知道怎么回事（我也不知道怎么回事，请知道这个公式怎么来的同学私戳我），推导出了第一个公式 表示苹果的重量， 表示苹果的均值， 表示苹果的真实均值， n为样本数 为x的真实标准差， 为x的样本标准差 表示 与 之间的误差的标准差，学名叫标准误，standard error （se） 该公式是说，如果我对一颗苹果树抽样，取n个苹果，那么我们可以认为苹果的样本均值概率应该服从 以 为中心,标准差为 的正态分布 注意： 这里描述的是采样均值的分布，不是采样个体的分布，即你采样很多次，每次计算出的均值放在一起，是这样一个正态分布 这里可能难以理解，于是老张又画图说明 这张图这么理解，这里很重要 ， 我是上帝，我知道苹果树的苹果真实均重300g，标准差10g，我从一种树上摘了30个苹果，对苹果的取样应该，其均值应该是 以300为中心，标准差为 = 1.8 的正态分布。 张三不是上帝，张三只能根据采样，他发现样本均值为298，标准差为7.78，（图中蓝色部分）。 但是他对真实的均值和标准差一无所知 ，所以聪明的张三，反其道而行，他说， 既然能用真实的均值和方差推测样本的均值，是不是可以用样本的均值和方差推测真实均值 ，套用上面的公式，推测苹果的真实均重概率应该是图中红线那样，以298为中心，标准差为 = 1.42， 这就是对真实均值力所能及最好的判断 这时候，张三转念又想，怎么比较A和B的差异呢，眼珠子那么一转，有了！ 我们既然比较AB之间的差距，为什么不去计算 A均值-B均值呢， 张三说要有X，我们就有了X 这是，我们只要检验 X = 0 是否成立就行了，我们的零假设是AB无差异，即X=0， 如果零假设成立，那么X的分布应该是一个以0为中心的分布，该分布的方差，应该是 方差 + 方差 ，即： 有了这样的分布，我们就可以描述每次抽样X在某个范围的概率 张三画了第三张图 该曲线下面积占比其实就是零假设下的事件发生的概率。 P值计算的是零假设下的发生某事件或者更为极端事件的概率 如我取样后计算得到X=2， 按照正态分布可以计算得，从2到正无穷，曲线下面积占比为约0.025（右边红色部分），那么A比B大2或者大更多的概率是2.5%，这就是P值。2.5%这个概率够小，我们觉得零假设应该是在扯淡，于是拒绝零假设，选择备选假设，即认为AB有显著差异 上面其实是算单尾的情况，即比较A比B大，或者A比B小的情况，会先假定一个方向。而日常常用的是双尾t-检验，他不假设AB哪个大哪个小，所以如果算出X=2， 他会计算两边， 的曲线下面积，故数值上P值=0.05，是单尾的2倍 一般我们以5%作为阈值，只有在P<0.05时，我们才认为，零假设下，出现这么大的X的概率太小了，才会舍弃零假设，选择AB确实有差异这个备选假设。 因为双尾不假设AB哪个大哪个小，p值是单尾的两倍，所以更为严格。 我们一般都选双尾 说了这么多，我们来应用一下，比如我有基因A，我一顿操作处理了细胞，想通过qPCR看看A的表达变了没。 比如 我来编个数据， 那你说这个A的表达是变了还是没变？ 我也不知道，但我们可以假设A没变，看看我们获得这样的数据的概率，如果概率<0.05, 我们就舍弃这个假设。 在Excel中，可以直接算t-test,如图： 尽管上下两次计算的时候，他们的均值差大小相近，但由于第二次样本多，所以我们对真实均值的估计分布会精确一些，即正态分布更加修长苗条，他们同样的均值差情况下，第二种情况就落在正态分布更外侧的地方，曲线下面积更小。 很感谢，大家看到这里，还记得之前我出过一个qPCR处理的软件吗，这次推出了进化版，可以计算p值，程序会自动计算每个基因处理组与对照组的双尾t检验，还是一键全自动，熟悉的味道，更强的功能。同名公号后台回复 qPCR 领取。 2020-03-28

荧光标记收集PCR反应产物。qpcr下游实验原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测，实验内容是荧光定量PCR在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应荧光染料收集PCR反应产物。

数字PCR是新型起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可直接获得DNA分子的拷贝数，实现其实样品中核酸分子的绝对定量，且无需标准品或内标。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域，如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子的检测、NGS数据验证、miRNA等微小差异表达研究、单细胞基因表达分析等方面，在已知突变的癌症分子标志物检测、传染病病原体检测、基因组三倍体分析和基因表达分析等领域展现了强大的优势。德国Qioptiq iFLEX系列超稳定低噪声激光器模块，是流式细胞仪、dPCR、共聚焦显微等仪器理想的激光器模块。此外，还可选择光束组合器组合多波长激光器，可以按照客户定制要求提供圆光斑或整形光斑，并且功率可调。payne@rayscience.com

RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）和qPCR（定量聚合酶链反应）是两种常用的分子生物学技术，用于检测和量化特定DNA或RNA序列。RT-PCR主要用于检测和扩增RNA序列。首先，RNA通过逆转录酶转录成cDNA（互补DNA），然后使用聚合酶链反应扩增目标序列。RT-PCR在基因表达研究、病毒检测等领域广泛应用。qPCR是一种定量分析技术，可用于准确测量DNA或RNA的初始数量。它通过荧光探针或DNA染料监测PCR反应过程中的DNA合成量。qPCR可以提供准确的基因表达水平、病原体数量等信息。

qPCR数据处理方法为△△Ct法原理【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。1、先来了解一下什么是Ct值？阈值循环数Thresholdcycle(Ct)也写作Cq值，荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline）。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系,起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性较好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相对稳定的。

实时定量PCR(qPCR)和数字PCR(dPCR) qPCR主要使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)。通过监测PCR期间的荧光强度，可以比较多个样品的DNA水平。数字PCR(dPCR)的基本工作原理很简单。先将样品分为多个PCR反应，每个反应多包含一个模板。然后通过对阳性和阴性反应进行计数来确定初始样品中模板分子的数量。

实时荧光定量PCR（qPCR）即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Cq值和标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。根据Real-time qPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类，包括TaqMan@探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；一类为非探针类，其中包括如SYBR Green或者特殊设计的引物(如LUX Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。荧光监测上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增技术俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。如今PCR技术早已走出实验室，在遗传学鉴定和疾病诊断中发挥着巨大的作用，在越来越广阔的领域里焕发着新的活力。技术用于实践

内容目录： RT-qPCR简介 RT-qPCR逆转录过程 RT-qPCR 的 qPCR 过程 定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。 RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1、表1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。 在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用1。 在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物（图2，表2）。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。 逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶（AMV）。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。 RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解（图3）。 用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。 如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。 一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中，以检测 DNA 污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR 扩增，则极有可能来自 DNA 的污染。

荧光定量PCR技术是在PCR技术的基础上发展而来的，PCR技术是由人创造的模拟基因组DNA自然条件下的复制的一项技术。我们都知道，基因组要完成复制才能发生细胞的分裂；如果基因组不能复制，那么随着细胞的分裂，基因组会被逐渐稀释。正是由于基因组的半保留复制，才使得物种的繁衍得到生生不息。正如上所述，基因组的复制是以半保留复制的方式进行的；在复制时DNA双螺旋链解旋，裸露出需要互补配对的碱基，这个时候细胞内的dNTPs、DNApolymerase等成分纷纷进入功能空间，随着时间的推移一条与原来模板链互补配对的新链产生了。人们在阐释了基因组的复制以后，开启了创造性模拟这一自然发生的生化反应的探索实践，并最终于1985年由美国的K.B.Mullis成功发明，Mullis还因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。（试吧商城【shibamarket】）简单来说，PCR技术就是将引物（可以与DNA单链模板互补配对的一小段DNA寡核苷酸链）、模板、dNTPs、DNAploymerase、反应Buffer、ddH2O等配制成一个反应体系，然后按照反应所需要的温度顺序进行温控式执行反应；经过数十个循环以后，产生不计其数的与原始模板序列几乎一样或互补配对的新生序列，这样就得到了大量的用于后续实验的DNA模板。（试吧商城【shibamarket】）荧光PCR技术是在PCR技术日趋完善的基础上，为了能实时监测PCR反应过程中的所需DNA片段含量的发展变化，科研工作者又对DNA与荧光小分子的相互作用进行了深入研究并取得大量积极的成果；而后将两项技术结合起来，并融合了快速发展的计算机软件技术，形成了这种可以既能精确地控制PCR反应所需的温度变化要求，又能实时地收集反应体系受到激发光照射后产生的荧光信号，还能将这种荧光信号转变为计算机软件可接受并处理的电子信息；并最终诞生了实验人员通过计算机软件就可以控制和检测普通PCR体系的RealTimeqPCR技术。RealTimePCR体系与一般PCR体系在成分组成上多出了小分子荧光染料或荧光探针这一成分。在温度控制方面多出了DNA熔解这一程序，就是通过梯度式地变化温度，使DNA双螺旋逐步分离开来；因为荧光染料只有嵌合在DNA双螺旋上才能被激发产生荧光，所以通过检测荧光信号的变化峰值就可以推断出引物的特异性如何，换句话说就是可以分析所扩增的DNA双螺旋有几种序列组成。（试吧商城【shibamarket】）通过此技术，可以使实验人员利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法；并利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Real-TimeqPCR技术即实时荧光定量PCR技术避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性。当然，反转录酶的发现和利用使RealTimePCR技术的适用范围由现成DNA为模板扩大到间接地以RNA为模板。该技术目前已被广泛应用于监测处理后细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异、验证基因芯片、验证引物特异性、检测siRNA干扰的实验结果、检测非翻译RNA的表达变化、检测细胞富集度、验证表观遗传学的影响等等。（试吧商城【shibamarket】）

一、QPCR原理“qpcr原理是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法；应用于对PCR进程进行实时检测。检测方法：加尾法和颈环法miRNA很短，用mRNA的反转录方法无法得到足以定量的cDNA。所以，miRNA的反转要求将miRNA序列进行延长，目前常用的序列延长反转录法包括茎环法和加尾法。特色：①RNA加尾和引物延伸法，样本用量少（1μg）且不需分离miRNA。②采用通用反转录引物，一次反转录产物可用于上百个miRNA检测。③检测通量高，可同时检测数十个miRNAs。④不同末端成熟miRNA都能被加尾和反转录，保证定量准确性。⑤配合QIAGEN试剂盒，保证实验可靠性；⑥扩增产物特异性高，通过产物热解离曲线（融解曲线）判断。

目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。实时荧光定量PCR 技术的主要应用：DNA或RNA 的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

一、原理在指数阶段，PCR 产物的量在每个循环中大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应组分被消耗，最终一种或多种组分变得有限。此时，反应减慢并进入平台期。最初，荧光保持在背景水平，即使产物以指数方式累积，也无法检测到荧光的增加。最终，足够的扩增产物积累以产生可检测的荧光信号。发生这种情况的循环数称为量化循环，或 q。由于 q值是在试剂不受限制的指数阶段测量的，因此可以使用实时 qPCR 根据描述反应进程的已知指数函数可靠和准确地计算反应中存在的模板的初始量。反应的 Cq主要由扩增反应开始时存在的模板量决定。如果在反应开始时存在大量模板，则需要相对较少的扩增循环来积累足够的产物以产生高于背景的荧光信号。因此，反应将具有低的或早期的 Cq。二、应用实时荧光定量 PCR/qPCR 检测已成为快速、灵敏地测定和定量各种生物样品中核酸的首选工具，具有多种应用，例如基因表达分析、食品中转基因生物的检测和癌症表型分析.在研究实验室中，qPCR 测定广泛用于定量测量转化细胞系中的基因拷贝数（基因剂量）或突变基因的存在。与逆转录 PCR (RT-PCR) 相结合，qPCR 分析可用于精确定量基因表达的变化，例如，通过测量细胞的变化，响应不同环境条件或药物治疗的表达增加或减少mRNA水平。qPCR/实时 PCR 仪器实时 PCR 检测系统由配备光学检测模块的热循环仪组成，用于测量每个扩增循环期间荧光团与目标序列结合时产生的荧光信号。Bio-Rad 实时 PCR 检测系统具有热循环仪和可互换的模块，用于荧光团的单重和多重检测以及固定的实时 PCR 单元。所有 qPCR 系统都具有热梯度功能。

　　qpcr原理：通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。qpcr应用于大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。　　1、qpcr是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。　　2、Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进行DNA复制。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。　　3、由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接输出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。

一、原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1、 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。二、应用1、基因表达分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间。2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%。整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室。2、检验生物芯片的结果；3、siRNA与miRNA诊断；4、基因型鉴定；5、饮食分析；6、兽医微生物检测。特点1、荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。2、每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。

qpcr原理是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。因而发达国家在相关方法和仪器方面的研发非常快，成为分子生物学诊断的主流。应用行业：各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。扩展资料实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。参考资料来源：百度百科-QPCR

crisper的本质是细菌的一种保护机制。1、crisper介绍。CRISPR是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统。利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统，是古菌和细菌抵抗病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。2、crisper的功能特点。CRISPR是生物科学领域的游戏规则改变者，这种突破性的技术通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶发现、切除并取代DNA的特定部分。这种技术的影响极其深远，从改变老鼠皮毛的颜色到设计不传播疟疾的蚊子和抗虫害作物，再到修正镰状细胞性贫血等各类遗传疾病等等。该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。crisper的技术运用：1、CRISPR技术可以纠正导致疾病的基因错误。肥厚型心肌病（HCM）是一种心脏疾病，影响着全球0.2%的居民，该患者群体将承受巨大的痛苦，而且该疾病会致命。通过使用这项技术，有可能减轻这种遗传性疾病对家庭造成的负担，最终影响全人类。2、CRISPR技术可消除导致疾病的微生物。虽然艾滋病治疗是从感染致命病毒转变为健康状态，但是科学家仍没有找到有效的解决办法。这种状况可能会随着CRISPR技术的发展而改变，研究人员对使用CRISPR技术设计噬菌体保持乐观态度，因为它们是一种经过验证的、安全的治疗细菌感染方法。3、CRISPR技术可培育更健康的新型食物。CRISPR基因编辑技术被证实在农业研究领域具有发展前途，美国纽约冷泉港实验室科学家使用CRISPR工具能够增大番茄产量，该实验室开发一种方法能够编辑基因，确定番茄的大小，分枝结构以及最大产量时番茄的外形。

TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) 和 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 都是现代基因编辑技术的代表，它们有以下相同点：都可以精确切割DNA：TALEN和CRISPR都是通过酶切酶的功能，识别和切割目标DNA序列。都需要设计与序列匹配的RNA或DNA：TALEN和CRISPR都需要特异性的引物来识别和结合目标基因，以进行基因编辑。都可用于修饰基因组中的特定位点：TALEN和CRISPR都能够精确编辑基因组中的特定位点，以产生所需的基因改变。都可以在细胞和生物体中应用：TALEN和CRISPR都可以应用于生物体中，包括单细胞和多细胞生物，以进行基因修饰。都可以被用于基因治疗：TALEN和CRISPR都是潜在的基因治疗方法，因为它们可以用于纠正病态基因。需要注意的是，TALEN和CRISPR的具体工作机制、设计原理和应用范围都有所不同，所以在具体应用时需要根据需求进行选择。

近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗·杜德娜和艾曼纽·夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。

方法/步骤1、确认自己安装的windows 8为VOL版本，在下载ISO安装文件时，应当就有意识地下载VOL版。（注：也可以在以下步骤的软件Microsoft Toolkit 2.4.3中查看是否支持。）从网络上下载Microsoft Toolkit 2.4.3，并保存到要激活的windows 8电脑上。（可以从百度里搜索下载。）2、双击运行Microsoft Toolkit 2.4.3，如果弹出是否允许运行，则选择“是”。3、如果上一步中没有安装.net framework 4.0，则会运行失败，并提示安装，这时可以从百度上下载并安装，如果没有提示，直接略过。4、windows 8系统一般不需要安装.net framework 4.0，如果提示的话，就安装吧。5、点击右下角windows图标运行,注：右侧的按钮为windows激活页面。6、在product keys中选择“windows 8"，选中对应版本，然后在key functions中点击Install，7、在Activation中点击“Activate"，等待完成，8、windows 8 vol激活完成，在系统属性里就可以查看激活的信息了。

microsoft toolkit激活工具使用方法：1、下载好toolkit工具之后，进入Microsoft Toolkit设置界面。2、进入Microsoft Toolkit设置界后,点击Activation选项卡下面选择要安装一个AutoKMS。3、再点击Product Keys选项卡下面选择你要激活的软件，选好软件版本以后，点击【Install】安装好以后，就需要重启电脑，此时再运行软件就激活了。4、重启电脑后如果360提示是否禁用AutoKMS一定不能禁用，如果禁用了Microsoft Toolkit所做的激活动作都没有效果了。

不是病毒。是一款Microsoft windows和office的KMS激活工具。由于是激活工具，所以有些杀毒软件将其视为病毒。

该脚本拓展工具包的某些功能不可用在这里，对象模型查看器无法使用。这会导致某些功能异常，比如，在输入代码时该有的提示没有出现而正常使用的时候，它是有输入提示的，类似于VS 2010里面的插件“Visual_Assist_X”，这个对代码的输入与检查的作用是非常大的。少了这些提示，会多走许多弯路呢。下面是正常使用时如下：导致它出现的根本原因是缺少了对象模型查看器的一些重要配置文件，以下情况下会导致它的缺失：一：使用了绿色版的脚本拓展工具包（ExtendScript Toolkit），而且里面缺少了一些重要文件，可能是绿化作者没有注意到而导致的异常。二：安装了脚本拓展工具包，但是由于某些原因（如，病毒、系统运行异常、清理垃圾……）把那些文件给清除了。解决方法是，将它所缺失的文件找回来，主要是两个文件夹（“APE”、“Scripting Dictionaries XXX”），按提示将需要的文件夹拷贝到相应的目录即可。最终，在”C:Program Files (x86)Common FilesAdobe”目录下应该有这两个文件将这些文件放置到正确的位置之后，就可以看到对象模型查看器能够正常使用了（我们在编写Adobe脚本的时候，通过这个对象模型查看器可以查阅所需要的API、方法了），而且代码的输入提示也有了。

crispr cas9技术原理如下：CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统,用来抵抗外源遗传物质的入侵,比如噬菌体病毒和外源质粒。同时,它为细菌提供了获得性免疫:这与哺乳动物的二次免疫类似,当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时,会产生相应的“记忆”,从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA,并将它们切断,沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰(RNAi)的原理是相似的。CRISPR-Cas9，一种基因治疗法，这种方法能够通过DNA剪接技术治疗多种疾病。2017年3月，英国《自然·通讯》杂志发表一项遗传学重要研究成果，利用CRISPR-Cas9系统可拯救失明小鼠。CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。该技术成果已应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。专利授权：2014年4月15日，获得了美国专利与商标局关于CRISPR的第一个专利授权。专利权限包括在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中使用CRISPR。这意味着拥有在除细菌之外的所有生物，包括老鼠、猪和人身上使用CRISPR的权力。

CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。

“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术技术近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。二、CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。1、“记录”入侵者档案其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。图1 CRISPR序列示意图其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。2、打击二次入侵者当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游

Crispr/cas9是种基因工具，在基因工程里修改调节基因etc.这个系统有两部分，guide RNA 用来和目标基因匹配（定位），Cas酶消化目标序列（两条链一起切）。

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[](javascript:void(0);) | CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的一种天然防御系统，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关酶(Cas)在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。 根据Cas蛋白的特点，可将CRISPR/Cas系统分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系统需要借助复杂的蛋白复合体发挥作用，Ⅱ型系统仅借助 Cas9蛋白和sgRNA即可对靶目标进行编辑，结构简单，操作容易，因此目前主要使用Ⅱ型CRISPR/Cas9 系统。 CRISPR/Cas自诞生以来，迅速发展，已经成为生命科学领域最耀眼、最有前景的技术。尤其是近两年，在全世界科学家的共同努力下，CRISPR/Cas相关新进展新突破不断涌现。 一、基因编辑技术的发展史 基因编辑可以分为三代，第一代：ZFN；第二代：TELEN；第三代：CRISPR/Cas。这三个基因编辑技术都利用了DNA修复机制，所以我们先来了解一下DNA修复机制（ 图1 ）。[图片上传失败...(image-8dab49-1625385468208)] 图1-NHEJ修复（左），HDR修复（右） NHEJ（Non-homologous end joining） 非同源性末端接合 NHEJ修复机制不需要任何模版，修复蛋白直接将双股裂断的DNA末端彼此拉近，在DNA连接酶的帮助下重新接合（ 图1 ）。 HDR（Homology directed repair） 同源重组修复 当细胞核内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，HDR才能发生。 NHEJ的机制简单又不依靠模版，因而NHEJ的活性相对于HDR高出许多。但NHEJ修复出错的概率较高，容易造成移码突变等，基因编辑正是利用了这一点（ 图1 ）。 1.ZFN的识别切割机制 融合锌指模块和FokI切割结构域形成ZFN ；以二聚体的形式靶向切割每个锌指结构；特异识别3个碱基 ；组装多个锌指结构(识别12-18bp)形成的ZFN对可特异切割基因组靶点 （ 图2 ）。 [图片上传失败...(image-3f1d8d-1625385468209)] 图2-ZFN基因编辑原理图 2.TALEN的识别切割机制 两个TALE靶向识别靶点两侧的序列；每个TALE融合一个FokI内切酶结构域；FokI通过TALE靶向形成二聚体切割靶点；设计灵活识别特异性强（ 图3 ）。 [图片上传失败...(image-6dcfc-1625385468209)] 图3-TELEN基因编辑原理图 3.CRISPR/Cas9的识别切割机制 crRNA通过碱基配对与 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA（ 图4 ）。 [图片上传失败...(image-c85235-1625385468209)] 图4-CRISPR/Cas9基因编辑原理图 ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9比较 [图片上传失败...(image-dd6344-1625385468209)] 图5-三种基因编辑的比较 二、CRISPR/Cas技术的介绍 CRISPR/Cas9 系统的发现 1987年，在大肠杆菌的基因组中首次发现了一个特殊的重复间隔序列——CRISPR序列，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。 2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。 2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成 前体crRNA (pre-crRNA)， pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，从而保护自身免受入侵。 2013年，发现CRISPR/Cas9系统可高效地编辑基因组。随后张锋等使用CRISPR系统成功的在人类细胞和小鼠细胞中实现了基因编辑。 从此开始，CRISPR/Cas9技术给生命科学领域带来了巨大冲击，CRISPR/Cas9相关研究成果频频登上CNS等顶级期刊，近两年更是成为诺贝尔奖热门候选。 CRISPR/Cas技术的原理 CRISPR/Cas9系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA，改造成具有引导作用的sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 的定点切割（图4）。 CRISPR/Cas技术的优势 设计简单，简明的碱基互补设计原则，识别不受基因组甲基化影响，能靶向几乎任意细胞任意序列，方便同时靶向多个靶点，切割效率高。 三、CRISPR/Cas的脱靶效应 PAM**** (Protospacer adjacent motif ) 前间区序列邻近基序 PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。如果靶序列 3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点。 PAM序列主要影响CRISPR/Cas9的DNA切割效率。在细胞水平上，NGG介导的切割效率是最高的。 sgR****NA ****(Single guide RNA ) 向导 RNA sgRNA与目标基因组相结合的 20nt 序列区决定着 CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性其实主要依赖于sgRNA与靠近PAM区的10~12 bp的碱基配对，而其余远离PAM序列 8~10 bp 碱基的错配对靶位点识别的影响并不明显。目前研究结果均提示，可能靠近 PAM 的 8~14 bp 序列是决定特异性的关键，其他序列也均在不同程度上影响脱靶效应。 CRISPR/Cas9的脱靶效应给研究带来了一定程度上的不确定性，也是限制其发挥更大潜力的主要原因之一。 2017年5月30日， Nature 杂志子刊 Nature Methods 刊登了美国哥伦比亚大学研究人员的一篇文章，研究人员通过CRISPR/Cas9成功修复了导致小鼠失明的基因后，对小鼠进行全基因测序，发现修复后的小鼠基因组有超过1500个单核苷酸突变，以及超过100个位点发生大片段插入或缺失（ 图6 ）。文章的结论无疑引发了巨大震动，也给正在进行中的CRISPR/Cas9带来了不确定性。 [图片上传失败...(image-f21b76-1625385468208)] 图6--动物体内实验中CRISPR/Cas9编辑后发生意想不到的突变 仔细分析后，发现该文章并不十分严谨，文章仅有两只小鼠作为实验组，一只作为对照组，数量不足以证明结论是否只是个例。而且单碱基突变是生物体内自然现象，不能全归于CRISPR/Cas9。整个实验只基于一个sgRNA数据，且该sgRNA特异性评分很低，造成脱靶效应也应该在预料之中（ 图7 ）。 [图片上传失败...(image-751d94-1625385468208)] 图7--针对 Nature Methods 文章的回应 经过一系列的研究和改进，目前CRISPR系统的脱靶性已经很低，当然，要想达到理想的状态，还有很长的路要走。 四、CRISPR/Cas技术的进展 2016年6月，张锋在 Science 发表文章，发现CRISPR/Cas13a能有切割细菌的特定RNA序列。 2016年9月，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，证实CRISPR/Cas13a可以用于RNA检测。 2017年2月22日，美国纪念斯隆.凯特林癌症中心（MSK）研究人员在 Nature 杂志发文，使用腺相关病毒（AAV）介导，将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于CAR-T疗法。该研究既解决了传统CAR-T疗法的随机整合可能存在的潜在危害，又大大降低了CAR-T细胞发生分化或癌化的风险，赋予了CAR-T技术全新的高效性、稳定性、安全性。 2017年8月2日，Shoukhrat Mitalipov在 Nature 发表长文，使用CRISPR/Cas9技术修正了植入子宫前的人类胚胎中一种和遗传性心脏病有关的变异。该研究证实了通过编辑人类胚胎进行治疗遗传病是安全可行的。值得一提的是，该成果受到了基因编辑领域大牛George Church等人的质疑。 2017年8月11日，杨璐菡等在 Science 发表文章，通过CRISPR/Cas9技术敲除猪基因组中的内源逆转录病毒（PERV）序列，并克隆出多只PERV失活小猪。向最终实现使用猪器官进行人体器官移植的终极目标迈进了一大步。 2017年9月，杂交水稻之父”袁隆平院士宣布使用CRISPR/Cas9技术敲除与镉吸收和积累相关基因的水稻育种成功。该研究从根本上解决了水稻镉污染的问题，将扭转我国部分农作物重金属超标的问题，进而改善部分人群重金属慢性中毒的问题。 2017年10月4日，张锋在 Nature 发表论文证实CRISPR/Cas13a能够在哺乳动物细胞中编辑特定的RNA。CRISPR/Cas13a能够达到RNAi相似的降低基因表达的效率，而且有更强的特异性，且对细胞内天然的转录后调控网络的影响更小。 2017年10月19日，Jennifer Doudna在 Nature 发表文章，设计了高精确性的Cas9变体—HypaCas9。该研究极大地降低了Cas9的脱靶效应，且不降低靶向切割效率。 2017年10月25日，张锋在 Science 发表文章介绍CRISPR新系统--REPAIR，可以高效的进行RNA的单碱基修复。因为不改变DNA序列，所以为通过基因编辑治疗遗传病而又不永久影响基因组提供了新可能。 2017年10月25日，哈佛大学Broad研究所的David Liu实验室在 Nature 发表长文，报道了新型腺嘌呤基因编辑器——ecTadA-dCas9，可以将A·T碱基对转换成G·C碱基对，该技术首次实现了不依赖DNA断裂即可进行基因编辑的技术，即单碱基基因编辑技术。该技术高于其它基因组编辑方法的效率，且几乎没有随机插入、删除或其它突变等不良副作用，因此为今后大范围治疗点突变遗传疾病提供了极大的便利。 五****、展望 近几年CRISPR/Cas基因编辑技术飞速发展，推广应用到了生物、医学、农业以及环境等多个领域，造就了一批批科研奇迹，尤其是在遗传病的治疗、疾病相关基因的筛查与检测、肿瘤治疗以及动植物的改造、病原微生物防治等领域有着巨大的潜力，也将深远地影响整个世界。 特别感谢：BioArt主编给予的帮助和意见以及吉满生物吴晨提供图1-图5的图片。 | | |

　　SOAP作为一种协议，同服务端Web Service进行通讯。微软提供了SOAP协议的SDK，SOAP Toolkit3.0是基于COM的一套SOAP开发组件。　　Microsoft SOAP Toolkit 3.0 提供一个灵活的框架，可以为各种 Intranet 和 Internet 解决方案构建可伸缩的 Web 服务。在这两种方案中，安全性都是建立可靠服务的重要因素。SOAP Toolkit 3.0 支持基于 IIS 安全基础结构的 Internet 安全性。本文介绍了如何使用 Microsoft SOAP Toolkit 2.0 建立安全解决方案。 简言之使用 Microsoft SOAP Toolkit 3.0 建立安全 Web 服务

　　中山大学人类胚胎遗传性致病基因修复实验采取了CRISPR／Cas9基因编辑技术。该技术是近年在锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术之后出现的新型基因编辑技术，原理来自细菌的适应性免疫防御机制。相比传统的基因打靶技术和其他基因编辑技术，CRISPR／Cas9更为精确、高效和经济。　　科学家发现，细菌在遭遇噬菌体等病毒侵染之后，可以获得其部分DNA（脱氧核糖核酸）片段并整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，转录出相应的RNA（核糖核酸），利用其中的“定位信息”引导Cas蛋白复合物定位和切割、彻底地摧毁入侵病毒的DNA。CRISPR／Cas9技术就是利用这一原理，用一种定制的RNA引导Cas，对预设DNA位点进行切割，造成DNA断裂，启动细胞内基因组修复机制，实现基因敲除、特异突变的修复或引入和定点转基因等。

1、首先，请确保你安装了office 2010软件，不论是office 2010专业版还是家庭学生版本，都可以。2、接下来，我们运行office 2010 toolkit 软件，看看软件的界面吧。由于是英文界面，所以还得给大家讲讲点击什么按钮才能开始激活。3、需要注意的是，大家必须首先要运行office 2010软件，不然的话，这个激活软件是无法使用的，切记。不运行软件的话，界面上激活的按钮显示的是灰色。4、我们在运行office 2010软件后，要选择一下激活密钥工具导入，具体看图片。具体的选择，要都尝试一下啊，因为可能有的选项无法激活，但有的就可以成功，主要是为了确保一下成功率。5、点击：EZ-Activator 按钮开始一键激活，看看效果吧。激活成功。6、打开自己的office 产品软件，看看是不是已经成功激活。图片上的office 2010软件显示已激活，成功。

CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。 一、什么是CRISPR-Cas系统 CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。 C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。 1、CRISPR（/"kru026aspu0259r/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌） CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。 ①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。 ②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。 ③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。 2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。 Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。 依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。 第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。 第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。 目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。 二、CRISPR-Cas9的作用原理 对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。 1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ） CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5" 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5" 到3" 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。 新间隔序列的获得可能分为三步： 第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。 第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。 第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。 2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工） CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。 crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。 3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰） crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。 随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。 三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用… tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。 CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。 CRISPR-Cas9的广泛应用 1、基因敲除（Knock-out） Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除 2、基因敲入（Knock-in） 当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率 3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation） Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。 4、多重编辑（Multiplex Editing） 将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。 5、功能基因组筛选 利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

　　Microsoft Toolkit是一款免费的Windows8激活/win8激活工具和Office2010/2013激活工具，是由Office 2010 Toolkit(Office2010激活工具)同一个作者制作。运行Microsoft Toolkit，点击界面右下角的Office图标进入Office Toolkit界面，点击Windows图标进入Windows Toolkit界面，对应激活Office2013和Windows8系统。　　老版本则支持win7和office2010　　1. 选择Microsoft Toolkit并“以管理身份运行”。　　2. 点击Office或Windows产品定义KMS服务器后续的操作步骤。　　3. 进入第二个选项卡“Activation”，并选择Tool操作方法“AutoKMS”　　4. 安装KMS服务，并在安装成功后点击“EZ-Activator”进行注册操作。u200b　　5. 安装成功后，显示结果。

CRISPR的全称Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，意为成簇规律间隔短回文重复序列，Cas则是CRISPR-associated (Cas) systems。 CRISPR/Cas 系统是原核生物的免疫系统，这个系统可以识别出外源 DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，用来抵抗外源遗传物质比如噬菌体病毒和外源质粒的入侵。这与真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。 CRISPR/Cas9 利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。现在使用的 CRISPR/cas 9 系统是由最简单的 type II CRISPR 改造而来，该系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成。 u26a0ufe0fnature video视频： CRISPR: 基因编辑原理及应用 基因敲除：sgRNA+Cas9 基因敲入：sgRNA+Cas9+目的基因（HDR模版） 5‘端开始数20个碱基这一段是需要设计的，这一段用来识别目的基因上的靶标，并通过碱基互补配对原理与靶点位置结合。 gRNA再往后数76个碱基，是另一段transactiviting RNA (tracrRNA)。它的序列是一定的，就像转运RNA一样可以形成空间结构，然后就可以和Cas9酶相结合。 这样一条完整的gRNA就可以识别靶点，并且把与它自身结合的Cas9酶带到这个靶点，引导Cas9酶在靶点处对目的基因的双链DNA进行切断，从而达到基因编辑的目的。 目前又很多在线工具可以用于设计sgRNA 不同的导入方式基因标记效率和脱靶效率不同 参考： CRISPR实验究竟怎么做？手把手教给你 CRISPR/Cas9 基因编辑全套操作和解决方案（TAKARA 讲解）

最后一行<Product activation successful>那不是显示激活成功了么？

ExtendScriptToolkit2CS时代就有的一个脚本编写工具,可以为你的PS写脚本,只要保存了,就可以为PS增加不错的功能,如将几十个图片批量做成一种式样,比PS自带的批量操作厉害得多,只要你懂编程。photoshop的辅助工具HKEY_LOCAL_MACHINESOFTWAREAdobeExtendScriptToolkit这个注册表键值删除其它你搜索下还有什么相关的删除吧！查看原帖>>

ZFNZFN，即锌指核糖核酸酶，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。TALENTALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。CRISPRCRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。但最近研究发现，虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。三种系统的比较那么，可能会有人疑问了，既然如此，这三种系统的区别和联系又是什么呢？特意从有效性，特异性，载体性及其它四个方面，进行了一个小小的总结。有效性在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的，并且这也依赖于每种细胞的转染的效率。因此，只能点对点的比较靶向位点，细胞系和转染方法，这样的比较才有意义。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验，我们在细胞系水平上进行了比较，虽然他们可能与不同的突变特征有关。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析，发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况，观察到，通过用CRISPR更换掉TALENs，在其他方面条件相同的情况下，通过产生更多的基因突变的克隆，本质上提高了效率。最近，功能上重新编码的TALENs（reTALENs）已经得到了发展，并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高。但是这个研究发现，CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率，并且其一定程度的比HE更有效率，挡雨ODN捐赠者进行比较。特异性ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的，其特异性是由DNA绑定的区域决定的，这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp。然而，在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸，它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的。这表明，3"12个碱基的“种子序列”是最关键的，而剩下的8个碱基（非种子序列）甚至PAM序列都是可以错配的。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行，并且发现存在频率低，但是可以检测到的脱靶事件的发生，其可以定义为一个高度有限的一部分。已经有研究表明，TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。基于这个研究，TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%，而在高度同源的CCR2位点上只有1%。相反，CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的，CCR5位点的突变频率是14%，而CCR2的是12%。几个研究也报告了，CRISPR/Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测（即，H2AX免疫染色）中都没有明显的脱靶现象。然而，最近的研究发现，CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象。例如，靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%，这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性，其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配，从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入（插入缺失）。此外，靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标，而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的。已经有报告说，脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服。此外，在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性。病毒为基础的传递ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递。当前，ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体，每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体。相反，腺病毒，但不是基于HIV的慢病毒，载体使用与TALEN的基因的传递，因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用。Cas9也是一个较大的基因，并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递，虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的。其他方面ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端，因此可以使用标签绑定，如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸（dsODN）是可以进行预测的。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势，绑定门通过设计实现了重组（Ob-LiGaRe）。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点，这是在没有改变接头区的方向实现的，因此通过相同的ZFN/TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化。因为CRISPR产生了一个非粘性末端，直接连接会遇到挑战。最近的文章表明，具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs，并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入。虽然至今还没有出版，但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/Cas9靶向位点的具有CRISPR/Cas的基因组使用。CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势，例如易于构建，花费低，并且产物具有可扩展性，并且能够用于多个靶向基因组位点。

1、运行Microsoft Toolkit.exe工具选择Office图标2、在主界面中切换到"Activation"页面3、按需KMSTool：AutoKMS然后点击Install进行安装KMS4、激活Office上面安装KMS成功之后点击 "Activate"按钮开始激活

http://jingyan.baidu.com/article/af9f5a2d02505143140a45fc.html参考一下

microsoft toolkit激活系统步骤如下： 确认自己安装的windows 8为VOL版本，在下载ISO安装文件时，应当就有意识地下载VOL版。、 从网络上下载Microsoft Toolkit 2.4.3，并保存到要激活的windows 8电脑上。 双击运行Microsoft Toolkit 2.4.3，如果弹出是否允许运行，则选择“是”。 如果上一步中没有安装.net framework 4.0，则会运行失败，并提示安装，这时可以从百度上下载并安装，如果没有提示，直接略过。如图：windows 8系统一般不需要安装.net framework 4.0，如果提示的话，就安装吧。 点击右下角windows图标运行,如图： 在product keys中选择“windows 8"，选中对应版本，然后在key functions中点击Install，如图 在Activation中点击“Activate"，等待完成，如图： windows 8 vol激活完成，在系统属性里就可以查看激活的信息了。