蛋白质

一般干重的蛋白含量在30%~70%，含量很高

去污剂,碱液,还有碱性的多糖壳聚糖等会影响测定；蛋白标准液最好现配现用；平行操作；显色后在半小时内测完

lowry法测蛋白质含量如下：Lowry法是一种常见的测定蛋白质含量的方法，往往包含在蛋白分离公司提供的服务中。Lowry法又称为Folin酚试剂法，通常测定范围是20～250μg，最低可检测5μg的蛋白含量，检测灵敏度范围在5～100μg/ml。Lowry法最早是由Lowry确定蛋白质浓度测定的基本步骤，以往在生物化学领域中广泛应用。Lowry法的显色原理是根据双缩脲反应，蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2＋反应，生成紫红色Cu＋复合物。Folin酚试剂在Cu＋的催化下，磷钼酸-磷钨酸盐被蛋白质中的芳香族氨基酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，其最大吸收峰在745～750nm处。在一定的浓度范围内，所形成蓝色的深浅与蛋白质含量之间有线性关系，可用于蛋白质含量的测定。在蛋白质混合物经过粗分离、纯化后，可以得到目的蛋白。蛋白分离公司提供的蛋白的粗分离服务首先是使用蛋白质提取缓冲液提实验材料，由于蛋白提取中目标蛋白质的浓度往往较低，需要采取一些简单的方法使目标蛋白浓缩，同时去除大量的杂质。然后根据蛋白质分子大小、分子性状、分子表面特征或分子带电状况进行进一步纯化，也就是蛋白质的细分级。在蛋白分离纯化后，使用Lowry法测重组蛋白的含量。美迪西提供蛋白分离服务，可以根据客户要求，承接从mg到kg级的化合物纯化分离服务。1、Lowry法测重组艾塞那肽蛋白含量有研究者对Lowry法测量重组艾塞那肽蛋白含量的不确定度进行分析和评价。通过建立Lowry法测量重组艾塞那肽蛋白含量的的数学模型，找出影响不确定度的因素，并对各个不确定度分量进行评估。结果计算出了各变量的不确定度，取包含因子K=2，置信概率为95%。发现此评价方法适用于Lowry法测量重组艾塞那肽蛋白含量的不确定度评估。2、Lowry法测重组人血清白蛋白-IL2融合蛋白含量该研究试验验证了Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法，为后续试验提供重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的检测方法。发现Lowry法测定重组人血清白蛋白-白细胞介素2融合蛋白含量的方法稳定、可重现。重组人血清白蛋白-白细胞介素2在200~10μg/mL质量浓度范围内均一。3、使用Lowry法的注意事项：（1）为了保证反应进行完全，反应在25~30℃水浴中进行，反应30min后准时比色。（2）由于产生的混合物的蓝色强度部分取决于酪氨酸和色氨酸含量，而它们在各种蛋白质中含量不同，因此会随不同的蛋白质而出现显色深浅的变化。通常用于酪氨酸和色氨酸的定量测定和蛋白质的相对浓度测定。（3）由于Folin试剂的主要成分为磷钼酸和磷钨酸，试剂仅在酸性pH条件下稳定，而还原反应又只在pH＝10～10.5范围内发生，因此在进行测定时，Folin酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中，必须立即混匀。（4）Folin试剂的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮蓝法取代。然而考马斯亮蓝法在蛋白质含量很高时线性关系稍偏低，且不同蛋白质与色素结合状况有差异。（5）在Lowry法中，由于加入Folin酚试剂强化了双缩脲反应，使得显色量增加，检测灵敏度提高且比较恒定。

目的是让溶液中的蛋白质和考马斯亮蓝进行充分的反应，使你的测定更加准确《复旦生命学院》为您解答，希望您能采纳

国家现行检测牛奶中蛋白质含量的方法是GB 5009.5-2010《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，具体的操作步骤请参见标准文本。

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植物蛋白中含脂化合物、叶绿素以及类胡萝卜素等植物色素和导致植物蛋白有不良风味和颜色的多酚类物质，影响植物蛋白提取后的纯度和质量。有机溶剂可除去这些化合物（如甲醇、四氯化碳等），且纯化剂的使用能提高叶蛋白的纯度近20％。实际上这是利用有机溶剂的相似相容原理，脂化合物、多酚类物质溶解于四氯化碳等有机溶剂，而植物蛋白不溶解于四氯化碳等有及溶剂，这样就将植物蛋白中的杂质萃取，使植物蛋白的纯度和质量得到提升。希望能帮得到你，也希望你能再查阅一下相关资料，不要偏信一家之言。

考马斯亮蓝法。利用生物法来发酵棉籽蛋白，并使用考马斯亮蓝法测定酵液中蛋白质含量的方法。利用蛋白质与考马斯亮蓝显色原理，用紫外分光光度法测定蛋白质含量，检测波长为595nm，蛋白质含量在0～16.67mg/L时与吸光度有良好的线性关系，测定所得标准曲线方程为y=0.044x+0.09，其中R=0.999。结果表明：这种方法快速、简便，RSD=3.86%（n=6）相对标准偏差小于4%，回收率90%。

　　在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465 nm 变为595 nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA 与Bradford试剂混合，测量在595 nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。　　考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。　　考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。　　考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：　　该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。　　1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。　　2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。　　3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。　　4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。　　5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．　　6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。　　注意：　　考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。长期以来，人们一直习惯用 Lowry 法来测定蛋白质浓度， 但近些年来， 越来越多的人开始用考马斯亮蓝 G-250显色法来测定蛋白质浓度，与 Lowry 法相比，该方法具有下列优点：①方法简单，只需一种显色液。②反应迅速，只需一步反应，显色可在 5 min 之内完成。③干扰少，许多被认为对 Lorwy 法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。尽管该方法有如此多的优点，但在实际应用中也有其缺点，如线性关系不很好，因此使用该方法测定蛋白质浓度时应特别注意。

1. 血浆样本放置时间太久,蛋白质变性;2. 实验比色杯由于 使用后未及时擦洗,导致比色误差(原因小);3. 人为操作 不当,导致误差

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因为制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量

相同的是两者均是通过显色反应来检测蛋白质的含量 区别 双缩脲法： 灵敏度低,检测最低浓度需要1～20mg,速度一般需要20~30分钟,硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸会对其有干扰. 考马斯亮蓝法： 灵敏度高,检测最低浓度仅需要1～5μg,速度快仅需5~15分钟,强碱性缓冲液；TritonX-100；SDS会对其有干扰.

第一：比色皿的配套性一定要做，第二：在每做完一个样品之后，比色皿是否完全洗净，第三：比色皿表面是否有污物（水渍、指纹、等）

考马斯亮蓝G250法测蛋白质含量比其他方法的优点是：1.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；2.其结合物在室温下1h内保持稳定。3.该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1,000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg.这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多. （2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间. （3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法.

蛋白质含量测定方法：1.紫外分光光度法蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定结果，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点：1.当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。2.若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。2.Bradford法1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，是一种能够迅速并且准确的定量蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度(最低检出量为1μg)。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子(如K+，Na+，Mg2+、)、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。总氮量的测定——微量凯氏定氮法：当被测定的含氮有机物与浓硫酸共热消化时，分解出氮、二氧化碳和水，其中氮与硫酸化合成硫酸铵。由于分解反应进行得很慢，故可加入硫酸铜和硫酸钾或硫酸钠，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂(过氧化氢)也能加速反应。消化终止后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸氨分解放出氨;用水蒸气蒸馏，将氨蒸入过量的标准无机酸溶液中，全部蒸完之后，用标准的盐酸溶液滴定收集的氨量，准确测定氨量，从而折算出蛋白质含量。3.双缩脲法具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中能与Cu2+络合呈紫红色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法进行测定，根据标准曲线进行计算可以确定蛋白质浓度。4.Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的经典方法，它是在双缩脲法的基础上发展而来的。它操作简单、迅速、灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。Folin-酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜-蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸-磷钨酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可发生此呈色反应。颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色法测定蛋白质的含量。此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，试剂B中的磷钼酸-磷钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混合均匀。以确保还原反应能正常发生。此法也适用与酪氨酸和色氨酸的定量测定。蛋白质：蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。蛋白质主要用于维持、生长、妊娠和泌乳等需要。因此蛋白质含量的检测成为一项日常性且必需性的工作。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量是0～1 000μg/mL。考马斯亮蓝一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。测定含量：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果，如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于细胞骨架的检验。浓染液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000mL，此染液放4℃至少6个月保持稳定。样本准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之间绘制标准曲线。溶解：将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。稀释：按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。作用：每个样本加5mL稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。计算：根据标准曲线计算待测样本的浓度。

用标准品做了标准曲线后，用EXCEL做出浓度和吸光度的方程，然后测得样品的吸光度代入方程，得到浓度！

1、凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。优点：可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。　缺点：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。2、双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。优点：测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。缺点：①灵敏度差；u2002②u2002三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。3、酚试剂法取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。缺点：①费时，要精确控制操作时间；②酚法试剂的配制比较繁琐。4、紫外吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。u2002缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差；u2002②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。5、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。参考资料来源：百度百科-蛋白质测定

1）灵敏度高,据估计比Lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg.这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质－染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多. （2）测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间. （3）干扰物质少.如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法. 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差. （2）仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH.（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）. （3）标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用Beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.

公式是根据测量结果自己算出来的：考马斯亮蓝比色法是由Bradford等人建立的1种测定微量蛋白质的方法L5]，考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成的蓝色蛋白质一染料复合物，在595nm处有最大吸光度，复合物1h内保持稳定。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质一染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的测定。测定时，用同一种标准蛋白（自己选，如牛血清白蛋白，所选的标准蛋白最好是纯化的待测蛋白——但这是理想状态，一般选择氨基酸构成与待测蛋白相近的标准蛋白。否则将影响测定结果）配制成覆盖待测样品蛋白浓度的标准蛋白溶液，然后加等量考马斯亮蓝G-250，混匀后用紫外分光光度计测定个标准蛋白样品的吸光值。并测定待测样品（可稀释成几个不同浓度的样品同时测）的吸光值。所有样品重复测三次。最后以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。计算出回归方程。如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度。只要上数据库一搜，这样的论文多的是，要加强自学能力呀！——赚点分真辛苦！

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你是指蛋白质还是氨基酸啊考马斯亮蓝是一种测定蛋白质含量的有效方法，但是这种显色反应要做标准曲线才可以知道确切含量而且你的是什么蛋白?氨基酸序列是什么?按照你的说法是大分子与大分子的聚合，这反应有选择性吗，如果是生成线性的，那肯定可以检测，因为只有端基参与了反应。

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465nm变为595nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA与Bradford试剂混合，测量在595nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。

在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465 nm 变为595 nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA 与Bradford试剂混合，测量在595 nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。

也称考马斯蓝染色法（coomassie blue staining）又称Bradford法，是 Bradford 于 1976 年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。4．按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。适用范围

bradford法测定蛋白质含量，也就是考马斯亮蓝法，其原理是考马斯亮蓝在游离状态下呈棕红色，最大光吸收在488nm; 当它与蛋白质结合后变为蓝色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量。不利因素主要是特殊蛋白的结构，缓冲液组分中有干扰试剂等。扩展资料：考马斯亮蓝法该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。参考资料来源：百度百科-考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是：灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。

国家现行检测牛奶中蛋白质含量的方法是GB 5009.5-2010《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，具体的操作步骤请参见标准文本。

应当可以用,两者区别不大,或者说就是同一物质,两者英文名字相同;相关系数低与何种蛋白无关,不知你用的什么方法,是福林酚还是什么方法,原因一般是溶液的体积没有量取准确或者相关的一些试剂没有配好;还有如果是类似福林酚法是不是A或B试剂加好后没有立即混合均匀或没有等待一定时间,一般严格按照方法操作,得出的回归方程的相关系数应当在0.99之上,

一、原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。 考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。 二、操作步骤 1. 标准曲线测定法 分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。 蛋白质标准曲线测定加样 试剂 空白 1 2 3 4 5 100ug/ml牛血清清蛋白/ml 1.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 牛血清清蛋白/ug 0 10 20 40 60 80 去离子水/ml 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 考马斯亮蓝G-250试剂/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 吸光值A595 2. 蛋白样品 配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。 在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。 3.试剂配置 a.牛血清清蛋白标准液 结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100 ug/ml的蛋白溶液。 b.考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到1000ml。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。

我也是一样的不能用

　　考马斯亮蓝G250法测蛋白质含量比其他方法的优点是：　　1.蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；　　2.其结合物在室温下1h内保持稳定。　　3.该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1,000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。　　考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

考马斯亮蓝测蛋白质计算公式：nh2ch2cooh+3h2so4—2co2+3so2+4h2o+nh3，考马斯亮蓝比色法是由Bradford等人建立的1种测定微量蛋白质的方法。考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合，形成的蓝色蛋白质一染料复合物，在595nm处有最大吸光度，复合物1h内保持稳定。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质一染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的测定。

是的

大概与样品中的干扰物质有关。干扰Folin酚法的物质有：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等。干扰考马斯法的：主要是去污剂，如 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。植物样品经常会含有酚类、有机酸等，提取蛋白可能用到Tris，这是常见的干扰物。检查一下操作程序吧。测定浓度时用buffer作空白对照了吧？

血浆样本放置时间太久，蛋白质变性。用户在用考马斯亮蓝法测蛋白质时，发现蛋白质含量偏高是由于血浆样本放置时间太久，蛋白质变性引起的。考马斯亮蓝是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。

蛋白质浓度测定方法：UV法，BCA法，考马斯亮蓝法等。1、UV法。这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白 质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受 到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。2、BCA法。原理BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。BioVision的BCA蛋白检测试剂盒提供了一种简单快速并且耐去污剂（大于5%）的手段检测溶液中蛋白质浓度。3、考马斯亮蓝法。考马斯亮蓝 (Coomassie Brilliant Blue) 法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、 标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、 蛋白质含量测定方法1、 凯氏定氮法2、 双缩脲法3、 Folin-酚试剂法4、 紫外吸收法5、 考马斯亮蓝法三、 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、 考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2、 标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。2、移液管使用（）。（三）、标准曲线制作：试管编号 0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色

原因如下:考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白质含量,仪器是752N型紫外可见分光光度计,采用牛血清白蛋白(sigma)做标准曲线,问题就出在标准曲线上,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度是生物化学中的经典实验,是利用蛋白质和染料结合的原理。

蛋白质浓度测定方法如下：1、双缩脲法检测原理：双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+ 络合成紫红色化合物（540nm）。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比。2、Lowry法检测原理：Lowry法是双缩脲法与福林酚法的结合与发展。Lowry法的包括两步反应，第一步是在碱性条件下，双缩脲试剂（碱性铜试剂），可与蛋白质中的肽键其显色反应，生成蛋白质铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂（磷钨酸和磷钼酸混合液）还原成钼蓝和钨蓝混合物而呈蓝色反应，颜色深浅与蛋白质含量成正比。3、BCA法检测原理：BCA与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+ 还原为Cu+ ，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫蓝色络合物。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。4、Bradford法检测原理：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。

用蒸馏水作替代蛋白质做对照就可以。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。

武大的同学吧？

考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。它染色灵敏度高，反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度A595nm值成正比。所以常用来测定蛋白质含量。

蛋白质含量的十种测定方法如下：一、直接测定UV法：这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。二、紫外吸收法：实验原理：大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。三、双缩脲法：实验原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。四、BCA法：实验原理：BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。五、Lowry法：实验原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。六、考马斯亮蓝法：实验原理：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。七、凯氏定氮法：实验原理：凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。八、Lowry法测定试剂盒：Folin酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将Folin试剂还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。定量范围为5～100μg/ml蛋白质。Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。九、BCA法测定试剂盒：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。常用浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。十、分光光度计法。1、取八支（或者更多）干净的10ml离心管，标记上号。2、取100ulBSA，加PBS2.4ml稀释至终浓度为0.2mg/ml。3、5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀，取10ml5×G250染色液，加入40ml双蒸水，混匀成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。4、按下表加入试剂（以每孔5ml计，多余的用来清洗比色皿）。

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量。以下引用：6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1) 2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2) (nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05n naoh配制。（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（cuso4?5h2o）和6.0克酒石酸钾钠（knac4h4o6?4h2o），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

1、凯氏定氮法准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化。消化完毕后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。2、双缩脲法双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色，Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，标准曲线上直接查出蛋白质含量。3、酚试剂法取6支试管标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致，混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。4、紫外吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。5、考马斯亮蓝法Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，出现沉淀，过滤除去。每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。参考资料来源：百度百科-蛋白质测定参考资料来源：百度百科-考马斯亮蓝法

1、凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。优点：可用于所有食品的蛋白质分析中；操作相对比较简单；实验费用较低；结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法；用改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。　缺点：凯氏定氮法只是一个氧化还原反应,把低价氮氧化并转为氨盐来测定,而不能把高价氮还原为氮盐的形式,所以不可以测出物质中所有价态的氮含量。2、双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。鉴定反应蛋白质单位1-10mg。优点：测定速度较快，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近。缺点：①灵敏度差；u2002②u2002三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。3、酚试剂法取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。优点：灵敏度高，对水溶性蛋白质含量的测定很有效。缺点：①费时，要精确控制操作时间；②酚法试剂的配制比较繁琐。4、紫外吸收法大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回收。u2002缺点：①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差；u2002②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。5、考马斯亮蓝法考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。参考资料来源：百度百科-蛋白质测定

你是指蛋白质还是氨基酸啊 考马斯亮蓝是一种测定蛋白质含量的有效方法,但是这种显色反应要做标准曲线 才可以知道确切含量 而且你的是什么蛋白?氨基酸序列是什么? 按照你的说法是大分子与大分子的聚合, 这反应有选择性吗,如果是生成线性的,那肯定可以检测,因为只有端基参与了反应.

　　在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465 nm 变为595 nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA 与Bradford试剂混合，测量在595 nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。　　考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。　　考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。　　考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：　　该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。　　1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。　　2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。　　3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。　　4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。　　5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．　　6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。　　注意：　　考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。长期以来，人们一直习惯用 Lowry 法来测定蛋白质浓度， 但近些年来， 越来越多的人开始用考马斯亮蓝 G-250显色法来测定蛋白质浓度，与 Lowry 法相比，该方法具有下列优点：①方法简单，只需一种显色液。②反应迅速，只需一步反应，显色可在 5 min 之内完成。③干扰少，许多被认为对 Lorwy 法有干扰的物质（如糖、缓冲液、还原剂和络合剂）不影响该方法。尽管该方法有如此多的优点，但在实际应用中也有其缺点，如线性关系不很好，因此使用该方法测定蛋白质浓度时应特别注意。

你是指蛋白质还是氨基酸啊考马斯亮蓝是一种测定蛋白质含量的有效方法，但是这种显色反应要做标准曲线才可以知道确切含量 而且你的是什么蛋白？氨基酸序列是什么？按照你的说法是大分子与大分子的聚合，这反应有选择性吗，如果是生成线性的，那肯定可以检测，因为只有端基参与了反应。

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

bradford法测定蛋白质含量的原理是考马斯亮蓝G250与蛋白质结合可以显色，用分光光度计在吸光度595nm处读数，通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线，再加待测蛋白与G250结合显色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量。不利因素主要是特殊蛋白的结构，缓冲液组分中有干扰试剂等。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量原理在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465 nm 变为595 nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA 与Bradford试剂混合，测量在595 nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

蛋白质含量测定考马斯亮蓝实验如下：实验原理：考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是：灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间；干扰物质少。

电渗析法是利用离子交换膜进行海水淡化的方法。离子交换膜是一种功能性膜，分为阴离子交换膜和阳离子交换膜【简称阴膜和阳膜】。阳膜只允许阳离子通过阴膜只允许阴离子通过，这就是离子交换膜的选择透过性。在外加电场的的作用下，水溶液中的阴，阳离子会分别向阳极和阴极移动，如果中间再加上一种交换膜，就可能达到分离浓缩的目的。电渗析法就是利用了这样的原理。利用半透膜的选择透过性来分离不同的溶质粒子（如离子）的方法称为渗析。在电场作用下进行渗析时，溶液中的带电的溶质粒子（如离子）通过膜而迁移的现象称为电渗析。利用电渗析进行提纯和分离物质的技术称为电渗析法。电渗析与电解不同之处在于：电渗析的电压虽高，电流并不大，维持不了连续的氧化还原反应所需；电解却正好相反。电渗析广泛应用于化工、轻工、冶金、造纸、海水淡化、环境保护等领域。特点：电渗析法处理废水的特点是；不需要消耗化学药品，设备简单，操作方便。基本原理：电渗析器中交替排列着许多阳膜和阴膜，分隔成小水室。当原水进入这些小室时，在直流电场的作用下，溶液中的离子就作定向迁移。阳膜只允许阳离子通过而把阴离子截留下来；阴膜只允许阴离子通过而把阳离子截留下来。结果使这些小室的一部分变成含离子很少的淡水室，出水称为淡水。而与淡水室相邻的小室则变成聚集大量离子的浓水室，出水称为浓水。从而使离子得到了分离和浓缩，水便得到了净化。电渗析和离子交换相比，有以下异同点：（1）分离离子的工作介质虽均为离子交换树脂，但前者是呈片状的薄膜，后者则为圆球形的颗粒；（2）从作用机理来说，离子交换属于 离子转移置换，离子交换树脂在过程中发生离子交换反应。而电渗析属于离子截留置换，离子交换膜在过程中起离子选择透过和截阻作用。所以更精确地说，应该把离子交换膜称为离子选择性透过膜；（3）电渗析的工作介质不需要再生，但消耗电能；而离子交换的工作介质必须再生，但不消耗电能。

所有蛋白质食物的英文这个你可以直接在百度上面去搜索一下上面会有很多关于蛋白质食物的英文你自己查一下吧

营养素是生命的物质基础，也是防病治病的物质基础，营养素不是越多越好，贵在平衡合理。人每天需要从饮食中获得的营养素有40多种，如必需氨基酸9种，维生素12种以上。微量元素14种等等，人体所需要的所有的营养素在每天吃的食物中都能获得。如正常人每天需要钙800—900mg，从饮食中补充12～16毫克的锌；铁的消化吸收与其它营养素不同,当身体需要铁时才会吸收,不需要时就不吸收。每天应吃的主要食物种类——谷类食物位居底层，每人每天应吃300～500克；第二层为蔬菜400～500克、水果100～200克；鱼、禽、肉、蛋等动物性食物位于第三层，每天应吃 125～200克（鱼虾类50克，畜、禽肉50～100克，蛋类25～50克）；奶类和豆类食物合占第四层，每天应吃奶类及奶制品100克和豆类及豆制品50克；第五层塔尖是油脂类，每天不超过25克。

ZeU=1/2 mv*v

转发自 http://crickcollege.com/news/220.html 质谱仪性能参数 我们作为质谱仪的使用者，怎么来评估一台质谱仪的性能呢？或者说，我们如何选择质谱仪呢？质谱仪主要的性能参数如下图，就让我来依次为大伙儿解释一下这些高大上的参数名称到底是啥意思吧。 检测限 “官方”的定义是，与三倍噪音相当的物质的量，我们可以理解为这是质谱仪能够检测到的最低含量化合物的浓度，或者量。比这个值再低的化合物，这台质谱仪就无能为力了。 我怎么知道我的质谱仪的检测限是多少呢？通常，我们会用利血平来作为一个标准的化合物测定质谱仪的检测限。比如，当我们在质谱仪中注入50 fg（飞克）利血平，如果我们获得的信噪比能达到100-1000，那么可以认为这台质谱仪的检测限是不错的。50 fg（飞克）利血平中大概只包含了几万个利血平分子，也就是说，如果能实现对含有几万个小分子的化合物进行检测，那么这台质谱仪的灵敏度是挺高的了。大家可以认为，灵敏度与检测限评估的是同一种性能。 线性范围 这个性能参数也是挺重要的。它表示在什么样的浓度范围之内，质谱仪检测到的信号与样品浓度之间成线性的关系。说得简单点，就是这个浓度范围内的样品，用这台质谱仪检测是比较合适的，高于或低于这个浓度范围的样品，需要浓缩或者稀释后才能用这台质谱仪检测。 通常情况下，质谱仪的线性范围是在3-6个数量级，也就是1,000 – 1,000,000这个范围之内。大部分质谱仪是在1,000 – 10,000这个范围内。 这个参数之所以重要，是因为当我们分析的样品含量分布非常广的时候，比如有的样品含量只有几十μg/ml，而有的样品含量可以达到几mg/ml。在这个比较宽的浓度范围内，如果质谱仪的线性范围非常好，我们不需要浓缩低浓度的样品，也不需要稀释高浓度的样品，可以直接进样，这样可以大大减少样品前处理的复杂程度，很好地节省时间，节省实验步骤。 分辨率和质量准确度 这是两个非常重要的参数，我们常说的高分辨质谱，指的就是分辨率特别高，且质量准确度特别高。这两个参数怎么理解呢？我们先来看看下面这个图： 分辨率 就是质谱仪可以分辨的最近两个质谱峰的质量差值。 这是啥意思呢？假设我有两个强度相同的质谱峰，当这两个峰很靠近的时候，我在什么情况下可以明确地判断出这是两个峰，而不是一个呢？基本准则就是，这两峰的重叠部分的高度，不超过任何一个质谱峰峰高10%的时候，我们认为这是两个可分离的峰。反之，如果这两个峰重叠的部分超过10%，就认为是不可分离的，也就是说，在处理质谱图时，是没办法按照两个峰值来处理的。 当两个峰实现10%基线分离时，我们来测定任何一个质谱峰的半峰宽（就是峰高一半处的峰宽），然后用任何一个峰的质荷比除以半峰宽，就可以得到分辨率。目前来讲，高分辨质谱仪的分辨率可以达到50,000-100,000的数量级，一般的四级杆可以达到5,000-10,000。 那么，高分辨质谱的优点如何体现呢？以上面的右图为例，当我们用低分辨质谱仪检测某种物质时，只能得到最外面蓝色的一个质谱峰，当我们不断提高分辨率，会慢慢发现，这一个质谱峰里面，其实包含了若干小的质谱峰，高分辨质谱仪得到的质荷比与低分辨获得的质荷比是有非常明显的差异。这对化合物鉴定来讲，是很重要的信息。如果我们把质荷比都算错了，我们是很难鉴定到正确的蛋白的。 下面这个图也能很直观地告诉我们质谱检测高分辨率的优势。 比如说，我们用17,500的分辨率来对一个化合物进行扫描，会发现在质荷比在280.09的这个位置，有一个非常胖的质谱峰（第一张谱图红色圆圈标记），我们可能会认为这是一个化合物，于是就开始对这个化合物进行鉴定。可是，当我们不断提高质谱仪的分辨率，到一定程度时，我们会发现，这其实是两个不同的峰（第四张谱图红色圆圈标记）。 也就是说，用低分辨率质谱里得到的质荷比来鉴定化合物，得到的信息其实是不完全的（不一定是错的），而通过高分辨质谱，我们就能获得更全面的化合物信息，帮助我们做出正确的判断。 质量准确度 是指质谱仪测到的质荷比与它实际的质荷比的差值，除以它真实的质荷比与1,000,000的乘积。所以它是以ppm为单位的（百万分之一），这个数值看起来更方便。目前高分辨质谱仪质量准确度在2-5个ppm的范围之内。 那么，我们怎么来测定一个质谱仪的实际分辨率及质量准确性呢？以李溱老师的一个实验数据为例： 比如，我们选质荷比是511.6这个峰，计算出它的半峰宽为0.012，于是它的分辨率就是511.6除以0.012，得到的值为42,500，而软件给出的分辨率是48,700，是很接近的。 同样的例子，我们来计算质量准确性。测到的质荷比是511.5978，而这个峰实际的质荷比是511.5995，于是计算出质量偏差为3.3ppm，也就是说此次实验的误差就是3.3ppm，这么一个质量偏差范围通常是可以接受的。 分辨率的重要性可能大伙儿容易理解，那质量准确性的高低到底对化合物鉴定会有怎样的影响呢？我们还是以利血平为例。 利血平分子，在质谱图中的609.28066处会有一个质谱峰。当我们用单四级杆来分析利血平的时候，单四级杆的质量准确性大约是在0.1个质量单位（165ppm）。也就是说，当把利血平注入一个四级杆质谱中，四级杆质谱会告诉我们，这个化合物的质荷比大概是在609.2-609.4这个范围之内。 那么问题就来了！在609.2-609.4范围内，我们用C、H、O和N四种元素可以组合出多少种在化学上可以存在的化合物呢？答案是：209种！也就是说，我们要判断这个化合物是不是利血平，得出正确结果的可能性只有1/209！ 当我们将质量准确性不断提高，可以组合出来的可能的化合物就会越来越少。当质量准确性达到3 ppm的时候，只有4种可能的化合物。当达到2 ppm的时候，得到的可能的化合物就只剩下2种了。这时候我们再来判断化合物是不是利血平，那么准确性就会高很多很多。这就是为什么高分辨质谱仪对于化合物鉴定来说非常重要，它可以大大减少候选化合物的数量，提高鉴定的成功率。 可以这么说，分辨率与质量偏差分别评估了质谱仪的精密度与准确性。就像我们打靶，比如我每次都能打到右上角一个点上，说明打靶的精密度非常高，但如果我的目标是靶心，那说明准确性却比较差。另一种情况，比如我打靶很多次，打中的点很分散，东一枪西一枪，但平均起来的位置刚好在靶心上，可以认为质量准确性还可以，但精密度比较差。所以我们希望的是，质谱仪的精密度和准确性都非常高。 目前我们能用到的高分辨质谱仪，不管是QTOF或者Orbitrap系列，都可以达到50,000以上的分辨率，同时也可以达到2-3ppm的质量准确性。所以说，如今做蛋白质组学研究的童鞋们，比起以前，真是幸福了很多！ 前面给大伙儿分享了评估质谱仪的几个重要参数。那接下来我们就针对不同质谱的性能做一个粗略的总结。1、 四级杆和离子阱：它们的质量扫描范围是有限的，通常情况下是在10-4,000。超过4,000，四级杆和离子阱就只能作为离子传输用，而不能用于离子检测了。它们的分辨率通常是2,000-4,000，好一点的离子阱可以达到10,000-20,000。扫描速度都不是很快，它们的优势是价格非常低，而且整个仪器可以做得非常小。 2、 TOF：它最大的优势是可以测量的质量范围理论上可以无限大和无限小。如果待检测的离子没有质量，那么它的飞行时间将是0，于是可以测到质荷比是0的离子。同理，如果离子的质量是无限大的，那么它的飞行时间也是无限长的，理论上也是可以检测的。TOF的分辨率是5,000-60,000，扫描速度非常快，它的缺点是，TOF需要一个非常长的离子跑道，所以仪器的体积会很大。 3、 FTICR：优势是分辨率非常高，可以达到1,000,000甚至更高，缺点是扫描速度比较慢，而且它需要一个超导磁铁，运行费用非常高，而且FTICR质谱仪本身的价格也很高，通常都在100万美元以上。 4、 Orbitrap：克服了FTICR必须要使用超导磁铁的缺点，它的分辨率可以达到100,000到1,000,000万，扫描速度不是很快，价格比FTICR要低一些。它受专利保护，目前只有Thermo公司可以生产。 对于蛋白质组学研究来讲，我们对质谱仪器性能的最低要求是：分辨率至少在40,000-50,000，质量准确性应该优于5ppm，质量扫描范围应该在100-3,000，扫描速度是每秒至少获得一张高分辨的一级谱图和十张高分辨的二级谱图。达到以上条件的话，就算是满足了我们做蛋白质组学最基本的要求。 串联质谱 上面讲到各种质谱仪的优缺点，那么我们这里引入串联质谱的概念：将相同或者不同的质谱仪串联起来，实现串联或者并联工作。这样做的目的有两个：产生二级碎片离子（为什么要产生二级碎片离子我们后来会讲），以及实现不同质谱仪性能的优势互补。 我们知道，不同的质谱仪性能是不同的。比如说，四级杆质谱可以实现离子选择，但它的分辨率比较差，而TOF不能实现离子的选择，但分辨率比较高。那么我们能不能把不同性能的质谱仪串到一起，让它们协同工作呢？我们通常会利用串联质谱或者MS-MS来实现这个需求。它们的结合方式有很多种： 第一种：三重四级杆（Triple Quadrupole），或者串联四级杆，就是把三个四级杆串联起来，这样做的主要目的是为了实现二级质谱的扫描。 第二种：四级杆和飞行时间质谱仪串联到一起，就是我们经常听到的Q-TOF，它实际上是为了提高二级质谱的分辨率。 第三种：Orbitrap与四级杆组合，比如Orbitrap Fusion，或者Orbitrap与离子阱组合到一起，比如说Orbitrap Elite等，就是这样的组合。 首先，我们聊一聊怎么通过串联质谱仪获得二级碎片离子。 上面是一个串联四级杆结构的示意图。串联四级杆，或者叫三重四级杆，它是由三个四级杆串联起来。通常，第二个四级杆是由六级杆或八级杆来代替，但我们还是叫它四级杆。这个四级杆不是一个质量选择系统，而是一个collision cell，即碰撞池，用来碎裂离子。 当串联四级杆工作的时候，第一个四级杆是开启了质量选择的模式，它让特定质荷比的离子穿过质谱仪，而把其它的离子都甩掉（甩到四级杆上，或者甩到四级杆的空间当中去）。然后，当特定的离子被选择好后（称为母离子），会进入碰撞池。 在碰撞池里有这样一个结构，就是入口和出口存在电压差，通常入口电压会高于出口电压，当母离子进来以后，通过电压差的作用，就会被加速。而且碰撞池里会充上氦气或氮气，当离子被加速以后，它就会与碰撞池里的氦气或氮气分子发生碰撞、碎裂，形成一些碎片，叫做fragment ions，也就是碎片离子，或者子离子。这些碎片离子会进到第三个四级杆中，进行二级的扫描，得到二级质谱图。 下图就是一个串联四级杆质谱仪，我们可以看到，它仍然是一个非常紧凑的结构。 三重四级杆 我们以莱克多巴胺为例，来看看它的分子通过串联质谱仪，会发生哪些变化，得到怎样的谱图。莱克多巴胺这是一种兽药。它的分子量是301.1672，结构式见上图。第一张图，测出来的质荷比为302.1744，这是一个一级质谱的扫描图，在302.1744处有一个莱克多巴胺的质谱峰。 然后呢，我们告诉质谱仪，把302.1744处的这个离子挑出来，将CID（碰撞诱导解离）电压设为10伏，即在碰撞池的入口与出口处增加一个10V的电压差，让离子以10V的碰撞能来进行碰撞。碰撞以后，在第二张图里，我们看到302处的信号强度变弱了，同时284和164的信号强度变强了，原来没有看到的107、121、136信号也出现了。 接下来，我们把碰撞电压从10V增加到25V，增加以后我们会发现，302处的信号完全消失了，表明原来在第一个四级杆中被选择出来的这个离子，经过高能量的碰撞后，完全碎裂了，碎成了91、107、121、136和164这样一些碎片离子。那么这些碎片离子都是什么呢？ 我们通过分析结构会发现，它们分别对应着莱克多巴胺的不同的碎片结构，比如164其实对应着莱克多巴胺右端的局部，136对应的是左半部分，等等。通过分析碎片的化学结构，我们就可以把它们拼装起来，拼成一个完整的莱克多巴胺分子。这就是我们如何通过二级质谱图，来实现对化合物的结构鉴定。而实际的鉴定过程常常会更复杂更伤脑筋一些，上面只是一个简单的示例。 那么对于多肽，或者说对于蛋白酶解后的多肽片段来说，我们可以通过同样的过程，通过分析一个多肽理论上可以得到哪些碎片，然后与谱图进行对比，就可以实现对多肽序列的鉴定。这部分后面会详细再讲。我们先来看个简单的例子，如下图：比如说我们有左上角这样一个肽段，理论上可以得到灰色标记出的各种b-y离子，通过分析质谱图，可以从中找到对应的碎片离子（右边表格里红色标记的都是可以从质谱图中找到的碎片离子），通过将这些信息拼装起来，我们就可以知道多肽的序列是什么。 上面通过以三重四级杆为例，跟大伙儿分享了串联质谱仪是如何获取二级碎片离子及二级谱图的。那么，其它一些串联质谱仪也是类似的过程。 Q-TOF Q-TOF与串联四级杆其实是非常像的，只不过它把第三个四级杆换成了一个飞行时间质谱仪。也就是说，一个四级杆，接一个碰撞池，然后接一个飞行时间质谱仪。为了增加飞行的距离，我们会让离子拐个弯再飞回来，这种叫反射模式飞行，让离子在更短的空间内可以飞得更远一些。下面这个图就是一个Q-TOF质谱仪，是Bruker生产的。它的飞行时间管（flight tube）的长度可以达到3.6米，离子飞一个来回是7.2米。这个数字大伙儿可以留意一下，后面在讲真空度的时候，还会再次提到。Orbitrap系列 Orbitrap系列比一般的串联质谱仪要复杂一些，大伙儿可以通过下面这个示意图感受一下。这个系列有好几种串联质谱仪，比如Q Exactive质谱仪，它的Q1也是一个四级杆，Q2是碰撞池，Q3是被一个Orbitrap所取代。再比如Orbitrap Elite，它的Q1是一个离子阱，Q2是一个碰撞池，Q3为一个Orbitrap，也就是说，Orbitrap Elite里面是没有四级杆的，它用一个离子阱代替了四级杆。 还有一款是Orbitrap Fusion（见下图），它是三种质谱仪混在一些的组合，它的第一级是四级杆，第二级是一个离子阱，第三级是一个Orbitrap，同时它还有一个碰撞池，整体是一个非常复杂的结构。它的特点是，Orbitrap与离子阱可以同步进行扫描。 一般的质谱仪里，两个质量检测量是不能同时扫描的，只能是一个作为质量检测的功能，另外一个作为过滤用。而Orbitrap Fusion里的离子阱和Orbitrap是同时可以进行扫描的，也就是说，它是一个并列的结构，而不仅仅是串联的，所以它的扫描速度会更快，性能也更好。Fusion的分辨率可以达到240,000 – 960,000。上面我分享了几种常用的质谱仪，那么以Q-TOF为例，我们再来学习一下质谱仪的基本构造。 对于质谱仪来说，最核心的部分就是质量分析器，它包括两个部分，就是前面我们详细介绍的质量过滤器和质量检测器。质谱仪所有其它部分都是为这个核心部分来服务的。 除了这个核心的组件以外，质谱仪还需要以下几个部分辅助： 质谱辅助系统 真空系统：为什么需要有真空系统呢？我们知道，质谱仪是一台检测气态离子质荷比的仪器，当一个气态离子在空气中飞行时，它会与空气分子发生碰撞，它带的电荷可能就会被撞没了，而成为一个不带电荷的气态分子，那么质谱仪就无法再测量它的质荷比了。所以我们希望得到的这个气态离子能够在质谱仪中稳定存在，所以质谱仪需要一个真空系统，让离子可以稳定地飞行，不受其它空气分子的干扰。 真空系统通常需要有两级，一级是低真空，由机械泵或油泵来提供，它可以大概1-3个mbar，也就是千分之一个大气压的压力环境，低真空的目的是为了给高真空提供一个后备压力环境。高真空是用涡轮泵来提供的，它的真空程度是-1E-5~-1E-10 mbar，在这样一个真空环境里，空气分子基本上都被抽干净了。 可能你想问，为什么要求这个数量级的真空条件呢？ 我们先引出一个概念，叫离子的平均自由程（mean free path），它的意思是，一个离子在一个真空环境中飞行多长的距离会碰到下一个空气分子。这就决定了离子在真空中可以稳定存在多久。 以串联四级杆为例，串联四级杆质谱仪大概有1米长左右，所以我们希望离子在飞行1米的过程中，不要碰到其它的空气分子。那么对于串联四级杆来讲，只要维持的真空度能保证1米距离内不会碰到空气分子就可以了。所以串联四级杆通常只需要-1E5 mbar的真空度。 而对于Q-TOF来说，离子的飞行距离大概是在5-7米（大伙儿还记得吗？前面介绍Q-TOF时专门提到了7米这个飞行距离），比串联四级杆的飞行距离长了将近一个数据级，所以Q-TOF质谱仪要求的真空度大约在-1E-6 ~ -1E-7 mbar，才能保证离子在飞行这么长的过程中，不会碰撞到其它空气分子。 而对于Orbitrap质谱仪，离子在里面飞行的时间可以达到1秒钟，会飞行非常远的距离，所以Orbitrap要求-1E-10 mbar这样的真空度。 离子源系统：我们需要把样品从外界大气压的非电离环境中导入质谱仪，变成一个气态的离子，所以需要一个离子源来实现这个功能。 计算机系统：实现质谱仪的控制和数据的采集。 气体系统：气体供应和废气处理（氮气、氩气） 电力供应：UPS不间断电源系统 加上核心组件质量分析器，以上就是组成质谱仪的六大系统。后面我们还会讨论每一部分的结构、使用以及维护。 安装好这六大组件的质谱仪可以用下面的示意图来表示。通常情况下，质量分析器和高真空的涡轮泵都会装在一个大盒子里，这个模块叫主机，而低真空泵（油泵）会放在主机的外面，因为这部分会产生很多的震动、噪音和热量，需要分开放置，从而防止震动对质谱仪产生的影响。质谱仪前面会有一个离子源，侧面会有一个废气口，质谱仪和泵产生的废气，通过这个排气管排到室外。尤其是泵产生的废气，通常是致癌的，所以排气尤其重要。日记本

转发自 http://crickcollege.com/news/179.html 为了直观一些，我们先上几张质谱仪的照片，大伙儿感受一下~ 质谱仪到底是个啥呢？我们还是先来掉个书袋吧，“官方”定义是这样的：用来测定气态离子质荷比（m/z）的仪器。对照的英文是：An instrument used to determine the mass-to-charge ratio (m/z) of gas phase ions. 我们来抓抓这里面的关键词：气态、离子、质荷比！ 从这几个关键词里，你感受到了吗？其实质谱仪检测的范围是非常有限的。首先，它只能检测气态的物质，其次，该物质还必须得是离子。而检测得到的数值也只是该离子的质量与电荷的比值！ 也就是说，当离子带一个正电荷或一个负电荷时，质谱仪检测到的m/z的数值就刚好等于离子的重量；当电荷数大于等于2时，我们得用检测到的m/z的数值乘以电荷数，才能得到离子的质量。 看到这里，你是不是有点感慨，原来大名鼎鼎的质谱仪，也就这点儿功能啊~我要说的是，功能不在多，而在专！就是这点功能，却引领了整个领域的革新！ 质谱仪的离子的质荷比测定到，可以通过质谱图展示。那么质谱图又是长什么样的呢？ 我们以上面两张质谱图为示例，质谱图的横轴就是质荷比，纵轴是离子强度。第一张是正丁烷的谱图，横轴质荷比的取值范围是从10到60。另一张是代谢物质谱图，横轴质荷比是100-400。那些小柱子就是信号峰了。 接下来，我们要聊的问题就是：质谱仪是如何获得这些质谱图？ 前面说了，质谱只能检测离子，所以要得到质谱图，首先我们要获得离子。离子分为两类：正离子和负离子，那么对应的，它们带正电荷或者带负电荷。 要生成一个正离子，其实就是分子结合一个或多个质子，就可以带上正电荷，这是最简单直接的办法；或者呢，让一个分子失去一个电子，也可以带上一个正电荷。相应的，生成负离子的方法，就是分子结合一个电子，或者失去一个质子。 我们还是以正丁烷为例，它的分子量是58，我们在质谱图的横轴（m/z）58处正好看到一个峰，说明是正丁烷的质谱图是正丁烷分子失去一个电子后，生成正离子而得到的。 我们再来看看另外一个例子，比如一个分子式为C22H25O3N3的化合物，通过计算知道它的分子量是379.1890，而在质谱图我们看到m/z轴上的峰是在380.1958，实际上是这个化合物得到一个质子后（分子量+1），形成正离子产生的质谱图。 所以呢，不同的质谱仪，不同的化合物，会得到不同的质谱图。比如第二个例子，如果你以为它的分子量就是380.1958，那计算出的结果肯定就是错的了。 那么，质谱仪是如何得到不同离子的质荷比信息呢？要回答这个问题，我们可以从质谱仪的种类和工作原理聊起。 磁质谱仪 前面说了，质谱仪是测定气态离子质荷比的仪器，所以进入质谱的离子一定得是带电的。当带电的离子进入电场或磁场时，它的飞行轨迹遵循一定的规律。比如我们把离子放到一个磁场当中，它飞行的时候会产生一个偏转，而偏转的半径与离子质荷比、磁场强度，以及它的动能有关，这就是洛伦兹力。通过检测它的偏转程度，就可以计算出它的质荷比。 所以最简单的质谱仪就是这种磁质谱仪，让离子飞过一个磁场，通过检测器检测它转弯的半径，就可以计算出它的质荷比。当然，现在这类质谱仪用得比较少了。接下来我们要介绍的TOF质谱仪更常用。 飞行时间质谱仪（TOF****） 这是目前很常用的质谱仪类型。它的工作原理是这样的，通过离子源得到离子以后，离子经过一个加速的区域，所有的离子都会获得一个相同的初始动能，然后它们进入一个没有电场的区域，进行自由地飞行！是不是画图很美？由于所有离子的初始动能是相同的，那么重的离子飞行速度就会慢一些，轻的离子飞得快一些，最终离子都会通过整个飞行区域，到达检测器。 通过测量离子的飞行时间，我们就可以推算出离子的质荷比。飞行时间是与质荷比的平方根成正比的。这就有点像跑步比赛，重的离子跑得慢一些，轻的跑得快一些，我们拿一个秒表，通过测定跑步时间，就可以计算出每个离子的质荷比了。这是一种原理很简单的质谱仪，也是目前使用广泛且性能很不错的质谱仪。 TOF质谱仪长什么样呢？我们来看看下面两个图。 这就是典型的飞行时间质谱仪的模样。因为我们要让离子在一个跑道上飞，就像奥运会上的跑步比赛一样，如果离子们都来跑100米，第一名和第二名可能只差0.01秒，区别起来会比较困难。但如果跑3000米，第一名与第二名可能会差10秒，甚至更多。所以跑道越长，我们越容易把离子区分开来。所以飞行时间质谱仪通常都需要有一个很长的飞行区间。 上图是两种典型的TOF质谱仪，左边是AB的4700质谱仪，它是竖着跑的，所以很高，有两米多。右边是Bruker的Ultraflex质谱仪，是横着跑的，长度也有两米多。所以TOF质谱仪的外表特点就是非常长，为了让离子能够尽可能跑得远一些。 **四级杆质谱仪 ** 除了TOF，还有一类很常用的质谱仪，就是我们经常听到的四级杆质谱仪。 为啥叫这个名字呢？如果我们来观察一下它的横截面，会发现，它是由四根电极组成的，电极的截面并不是完美的圆，而是双曲抛物线。 在横截面上，四根电极分成两组，两个相对的是一组，在相对的电极上加上一个相同的交流电压和直流电压，而在相邻的电极上，则加上相反的交流电压和直流电压，通过叠加交流电压和直流电压，不同质荷比的离子进入四级杆以后，会发生震荡，一边飞行，一边转圈。 当扫描的电压和频率一定的时候，只有特定质荷比的离子才能穿过四级杆，到达检测器。而其它质荷比的离子就会因为偏转太多，而打到四级杆上，或者从缝隙里穿出。 所以，四级杆质谱仪是用来做质量选择，只让特定质荷比的离子穿过质谱仪。通过改变四级杆上的电压，我们就可以让不同质荷比的离子依次穿过质谱仪，到达检测器。 四级杆质谱仪的外观通常都不会很长，在15-30cm左右，结构是比较紧凑。 离子阱质谱仪 还有一类质谱仪，与四级杆质谱仪非常相似，它就是离子阱质谱仪。分为两类，一类叫三维离子阱（3D Ion Trap）质谱仪，另一类叫线性离子阱（Linear Ion Trap）。 线性离子阱与四级杆质谱仪长得是非常像的，它的横截图跟四级杆质谱仪是一样的，只是它的侧面开了一个洞，来作离子弹出用的。四级杆质谱仪中，离子是穿过质谱仪飞出去的，而在离子阱质谱仪中，离子不会飞出质谱仪，而是一直在阱里面，沿着右下图像8字型的轨迹飞行。当扫描电压达到一定的数值以后，离子会被射出来。 离子的飞行轨迹示意图 对于三维离子阱，我们可以理解为，是将线性离子阱无限地压缩，压缩到最后变成这样一个很短的圆环，形成一个陷阱结构。三维离子阱有两个端电极和一对环形电极构成了一个封闭的空间，把离子困在里面。离子“阱”的名字就是这么来的，相当于是一个陷阱，把离子包在里面，一直进行转圈的运动。 离子阱与四级杆一样，可以通过改变加到离子阱上的扫描电压，让不同质荷比的离子射出来进行检测，也可以将特定质荷比的离子留在离子阱里面，进行后续的处理和操作。这是它们与TOF最大的不同，TOF只能检测不同质荷比的离子，却不能选择让哪些离子留下，而四级杆和离子阱既可以检测离子，同时也可以实现离子的选择，将想要的离子留在离子阱中，或者说，让特定的离子穿过四级杆。所以四级杆或离子阱还有一个名称，叫质量过滤器，它可以过滤特定质荷比的离子。 FTICR****和Orbitrap 我们要聊的第四类质谱仪是FTICR和Orbitrap，这类质谱是基于离子在电场或者磁场中会作回旋运动，通过测定回旋共振频率，并进行傅里叶变换，从而测定离子质荷比。 我们先来看看FTICR（见下图），它是将离子放到一个高强度的磁场中进行自旋共振，所以需要一个很大的超导磁铁，用来产生一个很强的磁场。 而Orbitrap则克服了必须要使用超导磁场的困难，它使用一个电场来限制离子的自旋共振。 image 这种类似的质谱仪都有非常高的分辨率，当然价格也很高。 以上就是我们常用的四类质谱仪：磁质谱仪、TOF、四级杆&离子阱、Orbitrap&FTICR，根据它们的原理和作用的不同，可以分为两大类： 1 质量检测器：仅可测定进入质谱仪的不同质荷比离子的丰度（TOF和Orbitrap等），不能选择离子通过质谱仪； 2 质量过滤器：测定不同质荷比离子的丰度，让特定质荷比或质荷比区段的离子通过质谱仪（四级杆和离子阱）。

说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由中国农业大学生物学院的李溱老师所授。 我们作为质谱仪的使用者，怎么来评估一台质谱仪的性能呢？或者说，我们如何选择质谱仪呢？质谱仪主要的性能参数如下图，就让我来依次为大伙儿解释一下这些高大上的参数名称到底是啥意思吧。 “官方”的定义是，与三倍噪音相当的物质的量，我们可以理解为这是质谱仪能够检测到的最低含量化合物的浓度，或者量。比这个值再低的化合物，这台质谱仪就无能为力了。 我怎么知道我的质谱仪的检测限是多少呢？通常，我们会用利血平来作为一个标准的化合物测定质谱仪的检测限。比如，当我们在质谱仪中注入50 fg（飞克）利血平，如果我们获得的信噪比能达到100-1000，那么可以认为这台质谱仪的检测限是不错的。50 fg（飞克）利血平中大概只包含了几万个利血平分子，也就是说，如果能实现对含有几万个小分子的化合物进行检测，那么这台质谱仪的灵敏度是挺高的了。大家可以认为，灵敏度与检测限评估的是同一种性能。 这个性能参数也是挺重要的。它表示在什么样的浓度范围之内，质谱仪检测到的信号与样品浓度之间成线性的关系。说得简单点，就是这个浓度范围内的样品，用这台质谱仪检测是比较合适的，高于或低于这个浓度范围的样品，需要浓缩或者稀释后才能用这台质谱仪检测。 通常情况下，质谱仪的线性范围是在3-6个数量级，也就是1,000 – 1,000,000这个范围之内。大部分质谱仪是在1,000 – 10,000这个范围内。 这个参数之所以重要，是因为当我们分析的样品含量分布非常广的时候，比如有的样品含量只有几十μg/ml，而有的样品含量可以达到几mg/ml。在这个比较宽的浓度范围内，如果质谱仪的线性范围非常好，我们不需要浓缩低浓度的样品，也不需要稀释高浓度的样品，可以直接进样，这样可以大大减少样品前处理的复杂程度，很好地节省时间，节省实验步骤。 这是两个非常重要的参数，我们常说的高分辨质谱，指的就是分辨率特别高，且质量准确度特别高。这两个参数怎么理解呢？我们先来看看下面这个图： 就是质谱仪可以分辨的最近两个质谱峰的质量差值。 这是啥意思呢？假设我有两个强度相同的质谱峰，当这两个峰很靠近的时候，我在什么情况下可以明确地判断出这是两个峰，而不是一个呢？基本准则就是，这两峰的重叠部分的高度，不超过任何一个质谱峰峰高10%的时候，我们认为这是两个可分离的峰。反之，如果这两个峰重叠的部分超过10%，就认为是不可分离的，也就是说，在处理质谱图时，是没办法按照两个峰值来处理的。 当两个峰实现10%基线分离时，我们来测定任何一个质谱峰的半峰宽（就是峰高一半处的峰宽），然后用任何一个峰的质荷比除以半峰宽，就可以得到分辨率。目前来讲，高分辨质谱仪的分辨率可以达到50,000-100,000的数量级，一般的四级杆可以达到5,000-10,000。 那么，高分辨质谱的优点如何体现呢？以上面的右图为例，当我们用低分辨质谱仪检测某种物质时，只能得到最外面蓝色的一个质谱峰，当我们不断提高分辨率，会慢慢发现，这一个质谱峰里面，其实包含了若干小的质谱峰，高分辨质谱仪得到的质荷比与低分辨获得的质荷比是有非常明显的差异。这对化合物鉴定来讲，是很重要的信息。如果我们把质荷比都算错了，我们是很难鉴定到正确的蛋白的。 下面这个图也能很直观地告诉我们质谱检测高分辨率的优势。 比如说，我们用17,500的分辨率来对一个化合物进行扫描，会发现在质荷比在280.09的这个位置，有一个非常胖的质谱峰（第一张谱图红色圆圈标记），我们可能会认为这是一个化合物，于是就开始对这个化合物进行鉴定。可是，当我们不断提高质谱仪的分辨率，到一定程度时，我们会发现，这其实是两个不同的峰（第四张谱图红色圆圈标记）。 也就是说，用低分辨率质谱里得到的质荷比来鉴定化合物，得到的信息其实是不完全的（不一定是错的），而通过高分辨质谱，我们就能获得更全面的化合物信息，帮助我们做出正确的判断。 是指质谱仪测到的质荷比与它实际的质荷比的差值，除以它真实的质荷比与1,000,000的乘积。所以它是以ppm为单位的（百万分之一），这个数值看起来更方便。目前高分辨质谱仪质量准确度在2-5个ppm的范围之内。 那么，我们怎么来测定一个质谱仪的实际分辨率及质量准确性呢？以李溱老师的一个实验数据为例： 比如，我们选质荷比是511.6这个峰，计算出它的半峰宽为0.012，于是它的分辨率就是511.6除以0.012，得到的值为42,500，而软件给出的分辨率是48,700，是很接近的。 同样的例子，我们来计算质量准确性。测到的质荷比是511.5978，而这个峰实际的质荷比是511.5995，于是计算出质量偏差为3.3ppm，也就是说此次实验的误差就是3.3ppm，这么一个质量偏差范围通常是可以接受的。 分辨率的重要性可能大伙儿容易理解，那质量准确性的高低到底对化合物鉴定会有怎样的影响呢？我们还是以利血平为例。 利血平分子，在质谱图中的609.28066处会有一个质谱峰。当我们用单四级杆来分析利血平的时候，单四级杆的质量准确性大约是在0.1个质量单位（165ppm）。也就是说，当把利血平注入一个四级杆质谱中，四级杆质谱会告诉我们，这个化合物的质荷比大概是在609.2-609.4这个范围之内。 那么问题就来了！在609.2-609.4范围内，我们用C、H、O和N四种元素可以组合出多少种在化学上可以存在的化合物呢？答案是：209种！也就是说，我们要判断这个化合物是不是利血平，得出正确结果的可能性只有1/209！ 当我们将质量准确性不断提高，可以组合出来的可能的化合物就会越来越少。当质量准确性达到3 ppm的时候，只有4种可能的化合物。当达到2 ppm的时候，得到的可能的化合物就只剩下2种了。这时候我们再来判断化合物是不是利血平，那么准确性就会高很多很多。这就是为什么高分辨质谱仪对于化合物鉴定来说非常重要，它可以大大减少候选化合物的数量，提高鉴定的成功率。 可以这么说，分辨率与质量偏差分别评估了质谱仪的精密度与准确性。就像我们打靶，比如我每次都能打到右上角一个点上，说明打靶的精密度非常高，但如果我的目标是靶心，那说明准确性却比较差。另一种情况，比如我打靶很多次，打中的点很分散，东一枪西一枪，但平均起来的位置刚好在靶心上，可以认为质量准确性还可以，但精密度比较差。所以我们希望的是，质谱仪的精密度和准确性都非常高。 目前我们能用到的高分辨质谱仪，不管是QTOF或者Orbitrap系列，都可以达到50,000以上的分辨率，同时也可以达到2-3ppm的质量准确性。所以说，如今做蛋白质组学研究的童鞋们，比起以前，真是幸福了很多！ 前面给大伙儿分享了评估质谱仪的几个重要参数。那接下来我们就针对不同质谱的性能做一个粗略的总结。 1、 四级杆和离子阱 ：它们的质量扫描范围是有限的，通常情况下是在10-4,000。超过4,000，四级杆和离子阱就只能作为离子传输用，而不能用于离子检测了。它们的分辨率通常是2,000-4,000，好一点的离子阱可以达到10,000-20,000。扫描速度都不是很快，它们的优势是价格非常低，而且整个仪器可以做得非常小。 2、 TOF ：它最大的优势是可以测量的质量范围理论上可以无限大和无限小。如果待检测的离子没有质量，那么它的飞行时间将是0，于是可以测到质荷比是0的离子。同理，如果离子的质量是无限大的，那么它的飞行时间也是无限长的，理论上也是可以检测的。TOF的分辨率是5,000-60,000，扫描速度非常快，它的缺点是，TOF需要一个非常长的离子跑道，所以仪器的体积会很大。 3、 FTICR ：优势是分辨率非常高，可以达到1,000,000甚至更高，缺点是扫描速度比较慢，而且它需要一个超导磁铁，运行费用非常高，而且FTICR质谱仪本身的价格也很高，通常都在100万美元以上。 4、 Orbitrap ：克服了FTICR必须要使用超导磁铁的缺点，它的分辨率可以达到100,000到1,000,000万，扫描速度不是很快，价格比FTICR要低一些。它受专利保护，目前只有Thermo公司可以生产。 对于蛋白质组学研究来讲，我们对质谱仪器性能的最低要求是：分辨率至少在40,000-50,000，质量准确性应该优于5ppm，质量扫描范围应该在100-3,000，扫描速度是每秒至少获得一张高分辨的一级谱图和十张高分辨的二级谱图。达到以上条件的话，就算是满足了我们做蛋白质组学最基本的要求。 上面讲到各种质谱仪的优缺点，那么我们这里引入串联质谱的概念：将相同或者不同的质谱仪串联起来，实现串联或者并联工作。这样做的目的有两个：产生二级碎片离子（为什么要产生二级碎片离子我们后来会讲），以及实现不同质谱仪性能的优势互补。 我们知道，不同的质谱仪性能是不同的。比如说，四级杆质谱可以实现离子选择，但它的分辨率比较差，而TOF不能实现离子的选择，但分辨率比较高。那么我们能不能把不同性能的质谱仪串到一起，让它们协同工作呢？我们通常会利用串联质谱或者MS-MS来实现这个需求。它们的结合方式有很多种： 第一种：三重四级杆（Triple Quadrupole），或者串联四级杆，就是把三个四级杆串联起来，这样做的主要目的是为了实现二级质谱的扫描。 第二种：四级杆和飞行时间质谱仪串联到一起，就是我们经常听到的Q-TOF，它实际上是为了提高二级质谱的分辨率。 第三种：Orbitrap与四级杆组合，比如Orbitrap Fusion，或者Orbitrap与离子阱组合到一起，比如说Orbitrap Elite等，就是这样的组合。 首先，我们聊一聊怎么通过串联质谱仪获得二级碎片离子。 上面是一个串联四级杆结构的示意图。串联四级杆，或者叫三重四级杆，它是由三个四级杆串联起来。通常，第二个四级杆是由六级杆或八级杆来代替，但我们还是叫它四级杆。这个四级杆不是一个质量选择系统，而是一个collision cell，即碰撞池，用来碎裂离子。 当串联四级杆工作的时候，第一个四级杆是开启了质量选择的模式，它让特定质荷比的离子穿过质谱仪，而把其它的离子都甩掉（甩到四级杆上，或者甩到四级杆的空间当中去）。然后，当特定的离子被选择好后（称为母离子），会进入碰撞池。 在碰撞池里有这样一个结构，就是入口和出口存在电压差，通常入口电压会高于出口电压，当母离子进来以后，通过电压差的作用，就会被加速。而且碰撞池里会充上氦气或氮气，当离子被加速以后，它就会与碰撞池里的氦气或氮气分子发生碰撞、碎裂，形成一些碎片，叫做fragment ions，也就是碎片离子，或者子离子。这些碎片离子会进到第三个四级杆中，进行二级的扫描，得到二级质谱图。 下图就是一个串联四级杆质谱仪，我们可以看到，它仍然是一个非常紧凑的结构。 我们以莱克多巴胺为例，来看看它的分子通过串联质谱仪，会发生哪些变化，得到怎样的谱图。 莱克多巴胺这是一种兽药。它的分子量是301.1672，结构式见上图。第一张图，测出来的质荷比为302.1744，这是一个一级质谱的扫描图，在302.1744处有一个莱克多巴胺的质谱峰。 然后呢，我们告诉质谱仪，把302.1744处的这个离子挑出来，将CID（碰撞诱导解离）电压设为10伏，即在碰撞池的入口与出口处增加一个10V的电压差，让离子以10V的碰撞能来进行碰撞。碰撞以后，在第二张图里，我们看到302处的信号强度变弱了，同时284和164的信号强度变强了，原来没有看到的107、121、136信号也出现了。 接下来，我们把碰撞电压从10V增加到25V，增加以后我们会发现，302处的信号完全消失了，表明原来在第一个四级杆中被选择出来的这个离子，经过高能量的碰撞后，完全碎裂了，碎成了91、107、121、136和164这样一些碎片离子。那么这些碎片离子都是什么呢？ 我们通过分析结构会发现，它们分别对应着莱克多巴胺的不同的碎片结构，比如164其实对应着莱克多巴胺右端的局部，136对应的是左半部分，等等。 通过分析碎片的化学结构，我们就可以把它们拼装起来，拼成一个完整的莱克多巴胺分子。这就是我们如何通过二级质谱图，来实现对化合物的结构鉴定。而实际的鉴定过程常常会更复杂更伤脑筋一些，上面只是一个简单的示例。 那么对于多肽，或者说对于蛋白酶解后的多肽片段来说，我们可以通过同样的过程，通过分析一个多肽理论上可以得到哪些碎片，然后与谱图进行对比，就可以实现对多肽序列的鉴定。这部分后面会详细再讲。我们先来看个简单的例子，如下图： 比如说我们有左上角这样一个肽段，理论上可以得到灰色标记出的各种b-y离子，通过分析质谱图，可以从中找到对应的碎片离子（右边表格里红色标记的都是可以从质谱图中找到的碎片离子），通过将这些信息拼装起来，我们就可以知道多肽的序列是什么。 上面通过以三重四级杆为例，跟大伙儿分享了串联质谱仪是如何获取二级碎片离子及二级谱图的。那么，其它一些串联质谱仪也是类似的过程。 Q-TOF与串联四级杆其实是非常像的，只不过它把第三个四级杆换成了一个飞行时间质谱仪。也就是说，一个四级杆，接一个碰撞池，然后接一个飞行时间质谱仪。为了增加飞行的距离，我们会让离子拐个弯再飞回来，这种叫反射模式飞行，让离子在更短的空间内可以飞得更远一些。 下面这个图就是一个Q-TOF质谱仪，是Bruker生产的。它的飞行时间管（flight tube）的长度可以达到3.6米，离子飞一个来回是7.2米。这个数字大伙儿可以留意一下，后面在讲真空度的时候，还会再次提到。 Orbitrap系列比一般的串联质谱仪要复杂一些，大伙儿可以通过下面这个示意图感受一下。 这个系列有好几种串联质谱仪，比如Q Exactive质谱仪，它的Q1也是一个四级杆，Q2是碰撞池，Q3是被一个Orbitrap所取代。 再比如Orbitrap Elite，它的Q1是一个离子阱，Q2是一个碰撞池，Q3为一个Orbitrap，也就是说，Orbitrap Elite里面是没有四级杆的，它用一个离子阱代替了四级杆。 还有一款是Orbitrap Fusion（见下图），它是三种质谱仪混在一些的组合，它的第一级是四级杆，第二级是一个离子阱，第三级是一个Orbitrap，同时它还有一个碰撞池，整体是一个非常复杂的结构。它的特点是，Orbitrap与离子阱可以同步进行扫描。 一般的质谱仪里，两个质量检测量是不能同时扫描的，只能是一个作为质量检测的功能，另外一个作为过滤用。而Orbitrap Fusion里的离子阱和Orbitrap是同时可以进行扫描的，也就是说，它是一个并列的结构，而不仅仅是串联的，所以它的扫描速度会更快，性能也更好。Fusion的分辨率可以达到240,000 – 960,000。 上面我分享了几种常用的质谱仪，那么以Q-TOF为例，我们再来学习一下质谱仪的基本构造。 对于质谱仪来说，最核心的部分就是质量分析器，它包括两个部分，就是前面我们详细介绍的质量过滤器和质量检测器。质谱仪所有其它部分都是为这个核心部分来服务的。 除了这个核心的组件以外，质谱仪还需要以下几个部分辅助： 真空系统 ：为什么需要有真空系统呢？我们知道，质谱仪是一台检测气态离子质荷比的仪器，当一个气态离子在空气中飞行时，它会与空气分子发生碰撞，它带的电荷可能就会被撞没了，而成为一个不带电荷的气态分子，那么质谱仪就无法再测量它的质荷比了。所以我们希望得到的这个气态离子能够在质谱仪中稳定存在，所以质谱仪需要一个真空系统，让离子可以稳定地飞行，不受其它空气分子的干扰。 真空系统通常需要有两级，一级是低真空，由机械泵或油泵来提供，它可以大概1-3个mbar，也就是千分之一个大气压的压力环境，低真空的目的是为了给高真空提供一个后备压力环境。高真空是用涡轮泵来提供的，它的真空程度是-1E-5~-1E-10 mbar，在这样一个真空环境里，空气分子基本上都被抽干净了。 可能你想问，为什么要求这个数量级的真空条件呢？ 我们先引出一个概念，叫离子的平均自由程（mean free path），它的意思是，一个离子在一个真空环境中飞行多长的距离会碰到下一个空气分子。这就决定了离子在真空中可以稳定存在多久。 以串联四级杆为例，串联四级杆质谱仪大概有1米长左右，所以我们希望离子在飞行1米的过程中，不要碰到其它的空气分子。那么对于串联四级杆来讲，只要维持的真空度能保证1米距离内不会碰到空气分子就可以了。所以串联四级杆通常只需要-1E5 mbar的真空度。 而对于Q-TOF来说，离子的飞行距离大概是在5-7米（大伙儿还记得吗？前面介绍Q-TOF时专门提到了7米这个飞行距离），比串联四级杆的飞行距离长了将近一个数据级，所以Q-TOF质谱仪要求的真空度大约在-1E-6 ~ -1E-7 mbar，才能保证离子在飞行这么长的过程中，不会碰撞到其它空气分子。 而对于Orbitrap质谱仪，离子在里面飞行的时间可以达到1秒钟，会飞行非常远的距离，所以Orbitrap要求-1E-10 mbar这样的真空度。 离子源系统 ：我们需要把样品从外界大气压的非电离环境中导入质谱仪，变成一个气态的离子，所以需要一个离子源来实现这个功能。 计算机系统 ：实现质谱仪的控制和数据的采集。 气体系统 ：气体供应和废气处理（氮气、氩气） 电力供应 ：UPS不间断电源系统 加上核心组件质量分析器，以上就是组成质谱仪的六大系统 。后面我们还会讨论每一部分的结构、使用以及维护。 安装好这六大组件的质谱仪可以用下面的示意图来表示。通常情况下，质量分析器和高真空的涡轮泵都会装在一个大盒子里，这个模块叫主机，而低真空泵（油泵）会放在主机的外面，因为这部分会产生很多的震动、噪音和热量，需要分开放置，从而防止震动对质谱仪产生的影响。质谱仪前面会有一个离子源，侧面会有一个废气口，质谱仪和泵产生的废气，通过这个排气管排到室外。尤其是泵产生的废气，通常是致癌的，所以排气尤其重要。 以上讨论了如何评估质谱仪的性能、串联质谱仪的工作原理，以及组成质谱仪的六大组件。下一篇将会聊聊液相色谱仪的构成，以及液质联用设备的工作原理。

说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由中国农业大学生物学院的李溱老师所授。 为了直观一些，我们先上几张质谱仪的照片，大伙儿感受一下~ 质谱仪到底是个啥呢？我们还是先来掉个书袋吧，“官方”定义是这样的：用来测定气态离子质荷比（m/z）的仪器。对照的英文是：An instrument used to determine the mass-to-charge ratio (m/z) of gas phase ions. 我们来抓抓这里面的关键词： 气态、离子、质荷比 ！ 从这几个关键词里，你感受到了吗？其实质谱仪检测的范围是非常有限的。首先，它只能检测气态的物质，其次，该物质还必须得是离子。而检测得到的数值也只是该离子的质量与电荷的比值！ 也就是说，当离子带一个正电荷或一个负电荷时，质谱仪检测到的m/z的数值就刚好等于离子的重量；当电荷数大于等于2时，我们得用检测到的m/z的数值乘以电荷数，才能得到离子的质量。 看到这里，你是不是有点感慨，原来大名鼎鼎的质谱仪，也就这点儿功能啊~我要说的是，功能不在多，而在专！就是这点功能，却引领了整个领域的革新！ 质谱仪的离子质荷比的测定，可以通过质谱图展示。那么质谱图又是长什么样的呢？ 我们以上面两张质谱图为示例，质谱图的横轴就是质荷比，纵轴是离子强度。第一张是正丁烷的谱图，横轴质荷比的取值范围是从10-60。另一张是代谢物质谱图，横轴质荷比是100-400。那些小柱子就是信号峰了。 接下来，我们要聊的问题就是：质谱仪是如何获得这些质谱图？ 前面说了，质谱只能检测离子，所以要得到质谱图，首先我们要获得离子。离子分为两类：正离子和负离子，那么对应的，它们带正电荷或者带负电荷。 要生成一个正离子，其实就是分子结合一个或多个质子，就可以带上正电荷，这是最简单直接的办法；或者呢，让一个分子失去一个电子，也可以带上一个正电荷。相应的，生成负离子的方法，就是分子结合一个电子，或者失去一个质子。 我们还是以正丁烷为例，它的分子量是58，我们在质谱图的横轴（m/z）58处正好看到一个峰，说明是正丁烷的质谱图是正丁烷分子失去一个电子后，生成正离子而得到的。 在负离子模式下是可以看到得到一个电子的分子的质谱图 我们再来看看另外一个例子，比如一个分子式为C 22 H 25 O 3 N 3 的化合物，通过计算知道它的分子量是379.1890，而在质谱图我们看到m/z轴上的峰是在380.1958，实际上是这个化合物得到一个质子后（分子量+1），形成正离子产生的质谱图。 所以呢，不同的质谱仪，不同的化合物，会得到不同的质谱图。比如第二个例子，如果你以为它的分子量就是380.1958，那计算出的结果肯定就是错的了。 那么，质谱仪是如何得到不同离子的质荷比信息呢？要回答这个问题，我们可以从质谱仪的种类和工作原理聊起。 前面说了，质谱仪是测定气态离子质荷比的仪器，所以进入质谱的离子一定得是带电的。当带电的离子进入电场或磁场时，它的飞行轨迹遵循一定的规律。比如我们把离子放到一个磁场当中，它飞行的时候会产生一个偏转，而偏转的半径与离子质荷比、磁场强度，以及它的动能有关，这就是洛伦兹力。通过检测它的偏转程度，就可以计算出它的质荷比。 所以最简单的质谱仪就是这种磁质谱仪，让离子飞过一个磁场，通过检测器检测它转弯的半径，就可以计算出它的质荷比。当然，现在这类质谱仪用得比较少了。接下来我们要介绍的TOF质谱仪更常用。 这是目前很常用的质谱仪类型。它的工作原理是这样的，通过离子源得到离子以后，离子经过一个加速的区域，所有的离子都会获得一个相同的初始动能，然后它们进入一个没有电场的区域，进行自由地飞行！是不是画图很美？由于所有离子的初始动能是相同的，那么重的离子飞行速度就会慢一些，轻的离子飞得快一些，最终离子都会通过整个飞行区域，到达检测器。 通过测量离子的飞行时间，我们就可以推算出离子的质荷比。飞行时间是与质荷比的平方根成正比的。这就有点像跑步比赛，重的离子跑得慢一些，轻的跑得快一些，我们拿一个秒表，通过测定跑步时间，就可以计算出每个离子的质荷比了。这是一种原理很简单的质谱仪，也是目前使用广泛且性能很不错的质谱仪。 TOF质谱仪长什么样呢？我们来看看下面两个图。 这就是典型的飞行时间质谱仪的模样。因为我们要让离子在一个跑道上飞，就像奥运会上的跑步比赛一样，如果离子们都来跑100米，第一名和第二名可能只差0.01秒，区别起来会比较困难。但如果跑3000米，第一名与第二名可能会差10秒，甚至更多。所以跑道越长，我们越容易把离子区分开来。所以飞行时间质谱仪通常都需要有一个很长的飞行区间。 上图是两种典型的TOF质谱仪，左边是AB的4700质谱仪，它是竖着跑的，所以很高，有两米多。右边是Bruker的Ultraflex质谱仪，是横着跑的，长度也有两米多。所以TOF质谱仪的外表特点就是非常长，为了让离子能够尽可能跑得远一些。 除了TOF，还有一类很常用的质谱仪，就是我们经常听到的四级杆质谱仪。 为啥叫这个名字呢？如果我们来观察一下它的横截面，会发现，它是由四根电极组成的，电极的截面并不是完美的圆，而是双曲抛物线。 在横截面上，四根电极分成两组，两个相对的是一组，在相对的电极上加上一个相同的交流电压和直流电压，而在相邻的电极上，则加上相反的交流电压和直流电压，通过叠加交流电压和直流电压，不同质荷比的离子进入四级杆以后，会发生震荡，一边飞行，一边转圈。 当扫描的电压和频率一定的时候，只有特定质荷比的离子才能穿过四级杆，到达检测器。而其它质荷比的离子就会因为偏转太多，而打到四级杆上，或者从缝隙里穿出。 所以，四级杆质谱仪是用来做质量选择，只让特定质荷比的离子穿过质谱仪。通过改变四级杆上的电压，我们就可以让不同质荷比的离子挨<ins cite="mailto:Zhen%20Li" datetime="2017-01-16T10:58" style="margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">依次</ins>个穿过质谱仪，到达检测器。 四级杆质谱仪的外观通常都不会很长，在15-30cm左右，结构是比较紧凑。 还有一类质谱仪，与四级杆质谱仪非常相似，它就是离子阱质谱仪。分为两类，一类叫三维离子阱（3D Ion Trap）质谱仪，另一类叫线性离子阱（Linear Ion Trap）。 线性离子阱与四级杆质谱仪长得是非常像的，它的横截图跟四级杆质谱仪是一样的，只是它的侧面开了一个洞，来作离子弹出用的。四级杆质谱仪中，离子是穿过质谱仪飞出去的，而在离子阱质谱仪中，离子不会飞出质谱仪，而是一直在阱里面，沿着右下图像8字型的轨迹飞行。当扫描电压达到一定的数值以后，离子会被射出来。 对于三维离子阱，我们可以理解为，是将线性离子阱无限地压缩，压缩到最后变成这样一个很短的圆环，形成一个陷阱结构。三维离子阱有两个端电极和一对环形电极构成了一个封闭的空间，把离子困在里面。离子“阱”的名字就是这么来的，相当于是一个陷阱，把离子包在里面，一直进行转圈的运动。 离子阱与四级杆一样，可以通过改变加到离子阱上的扫描电压，让不同质荷比的离子射出来进行检测，也可以将特定质荷比的离子留在离子阱里面，进行后续的处理和操作。这是它们与TOF最大的不同，TOF只能检测不同质荷比的离子，却不能选择让哪些离子留下，而四级杆和离子阱既可以检测离子，同时也可以实现离子的选择，将想要的离子留在离子阱中，或者说，让特定的离子穿过四级杆。所以四级杆或离子阱还有一个名称，叫质量过滤器，它可以过滤特定质荷比的离子。 我们要聊的第四类质谱仪是FTICR和Orbitrap，这类质谱是基于离子在电场或者磁场中会作回旋运动，通过测定回旋共振频率，并进行傅里叶变换，从而测定离子质荷比。 我们先来看看FTICR（见下图），它是将离子放到一个高强度的磁场中进行自旋共振，所以需要一个很大的超导磁铁，用来产生一个很强的磁场。 而Orbitrap则克服了必须要使用超导磁场的困难，它使用一个电场来限制离子的自旋共振。 这种类似的质谱仪都有非常高的分辨率，当然价格也很高。 以上就是我们常用的四类质谱仪：磁质谱仪、TOF、四级杆&离子阱、Orbitrap&FTICR，根据它们的原理和作用的不同，可以分为两大类： 以上是对质谱的原理和几种常见的类型做一个基本介绍，下一篇将继续分享质谱仪性能的几大指标，对质谱仪进行性能评估，以及串联质谱是如何协同工作的。

次氯酸钠和过氧化氢都是利用其氧化性,使蛋白质变性，乙醇（酒精）与水间氢键强于水溶性蛋白质与水间氢键.同时存在醇和水,与蛋白质发生氢键作用,从而破坏蛋白质与水间氢键,造成蛋白质结构变化.

X晶体衍射。首先要得到蛋白质的晶体。通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，工作便完成的80％，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。用x射线的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，甚至当天就能得到结构，另外不受大小限制，无论是多大的蛋白，或者复合体，无论是蛋白质还是RNA、DNA，还是结合了什么小分子，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件。 X射线衍射方向决定于晶体的周期或晶面间隔，但是，在周期相同或晶面间隔相同的情况下，由于晶胞内原子排布方式不同，则会造成衍射点强度不同。也就是说，衍射点强度的大小包含着与分子结构有关的信息。分子结构中所有原子对每一个衍射斑点的强度都有各自的贡献，因此，通过分析X射线衍射点的强度，可以得到有关晶胞内原子排布的信息。常用的晶体衍射强度的记录有两种方式。一种是将晶体所产生的衍射光束点记录在底片上，如经典的感光胶片，然后，用扫描仪阅读衍射强度。近年来发展起来的象板探测器，实际上是用象板取代了感光胶片，免除了显影、定影等麻烦。另一种方法是多丝正比面探测器，先将衍射光束光子信号转换为电子信号，再处理为衍射强度。还可以采用CCD技术，使数据采集精度和信号转换速度得到较大的提高。这非常重要，因为生物大分子晶体结构解析的分辨率和精度主要取决于晶体衍射数据采集的质量和精度。多波长反常散射法成为近年来发展较快的一种方法。生物大分子中通常含有金属离子或重原子，不同的原子对不同波长的X射线具有特征的反常散射效应。同步辐射光源具有强度高、单色性好、波长连续可调的特点，在进行生物大分子晶体衍射实验时，如果晶体中含有金属离子或重原子，则可以将同步辐射光源的波长调整到对应原子反常散射明显的位置，获得反常散射数据，从而进行晶体结构的解析。生物大分子的二级结构常常是螺旋结构（如蛋白质中的a螺旋和DNA的双螺旋），其特点是每一圈螺旋中(即每一周期)包含一定数量的、散射能力相同的结构单元。具有螺旋结构的生物大分子，其X射线衍射图有相应的特点。凡是衍射图上具有这些特点的物质，如纤维状蛋白质、DNA，其结构均为螺旋结构。利用从衍射图得到的衍射数据，可以分析出晶胞内三维空间的电子密度分布，确定结构模型。下面以肌红蛋白为例加以说明。肌红蛋白分子量为18000，含有153个氨基酸残基，分子中有1200个原子(不包括氢原子)。为了定出分子中所有原子的位置，需要测量大约20000个衍射点的强度并计算其位相角。第一阶段分析到603的水平，定出多肽链和正铁血红素的位置，其中棒状结构符合a-螺旋的特征，推算出a-螺旋约占残基总数的70%。进一步分析提高到203的水平，虽然不能定出每个原子的位置，但可以肯定分子的主要部分是由a-螺旋组成，而且是右手螺旋，链必须弯曲、盘绕。其中大约13~18个残基不是a-螺旋，一半以上的氨基酸残基能定出种类。再进一步分析到1.503的水平，可以完全弄清楚氨基酸排列顺序。这样，通过X射线衍射的研究，可以确定蛋白质一级、二级、三级结构。可见X射线衍射分析是研究生物大分子结构的强有力的工具。用X射线衍射技术分析分子结构时，一般有以下几个步骤：（1）用实验测定单个晶格的线度和从衍射图中测量衍射点的强度；（2）根据上述数据，结合其它方法推断原子排列，得到尝试结构模型，计算这种结构的衍射极大值，然后与实验观察值比较；（3）修正所提出的模型，直到计算结果和实际所得到的数据趋于吻合。X射线晶体学方法是测定蛋白质结构的主要方法。球状蛋白质是多肽链卷曲成团的蛋白质，它和纤维状蛋白不同，构型一般比较复杂。球状蛋白质分子量大，表面基团的构象不稳定，要获得有序排列的晶体是比较困难的。所形成的晶体不可能是完美的堆砌，而是会在分子之间形成许多大的孔或通道。这些通道常常由占晶体体积一半以上的溶剂分子所占有，而溶剂分子的绝大部分在晶体上又是无序的。晶体中的蛋白质分子之间仅有少量的区域发生接触，这些区域的相互作用也是较弱的相互作用，通常是通过一个或几个溶剂分子发生作用。蛋白质晶体的形成依赖于一些参数，如pH值、温度、蛋白浓度、溶剂的种类、沉淀剂的种类以及金属离子和某些蛋白的配基等。用X射线衍射图分析DNA的空间结构，出现螺旋结构的衍射图样，说明每一圈螺旋有10个重复结构单元，反映了分子间的排列情况。根据DNA的X射线衍射图结合其它技术，Watson和Crick提出了DNA的空间结构模型：两条多核苷酸链组成反平行的右手双螺旋，磷酸在外，碱基在内；螺距为3403，每圈螺旋包含10个核苷酸，每个核苷酸轴长为3.403，螺旋直径为2003；两条链之间形成氢键。

牛奶 牛奶含有丰富的钙,蛋白质等,营养神经系统。富含维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素D,营养价值高且易于消化吸收。 每天1-2次,300毫升左右即可。 西瓜 西瓜还有大量的维...

1、醋酸纤维素薄膜电泳 ：醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物，它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。醋酸纤维素膜薄是一种细密而又薄的微孔膜。醋酸纤维素膜对样品的吸附性较小，因此，少量的样品，甚至大分子物质都能得以较高的分辨率。又由于醋酸纤维素薄膜亲水性较小，故电渗作用也较小，并且它所容纳的缓冲液也较少，因此电流的大部分由样品传导，可以加速样品分离，大大节约电泳时间。醋酸纤维素具有操作简单、快速、价廉、定量容易等优点，尤其较纸电泳分辨力强、区带清晰、灵敏度高和便于保存、照相等，目前醋酸纤维素薄膜电泳己取代纸电泳而被广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。2、 琼脂糖凝胶电泳 ：琼脂糖凝胶电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳，其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅依赖于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大地提高了分辨能力。琼脂糖系天然的琼脂加工制得，天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖（约占80%）及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。所以常用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶等同工酶的分离和鉴定，为临床某些疾病的鉴别诊断提供了可靠的依据。与免疫化学反应相结合发展成为免疫电泳技术，用于分离和检测抗原。可对目前常用的琼脂糖进行某些修饰，如引入化学基团羟乙基，则可使琼脂糖在65℃左右便能熔化，被称为低熔点琼脂糖。该温度低于DNA的熔点，而且凝胶强度又无明显改变。以此为支持物进行电泳，称为低熔点琼脂糖凝胶电泳，主要应用于DNA研究。如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂又称为共聚体的N,N"-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。 4、等电聚焦电泳 ：等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的电泳介质来分离等电点(pI)不同的蛋白质的电泳技术。这是六十年代后期才发展起来的新技术，基本原理是在制备聚丙烯胺胶凝胶时，在胶的混合液中加入载体两性电解质(商品名Ampholine)。这种载体两性电解质是一系列含有不同比例氨基及羧基的氨羧酸混合物，其分子量在300～1000范围内，它们在pH2.5～11.0之间具有依次递变但相距很近的等电点，并且在水溶液中能够充分溶解。含有载体两性电解质的凝胶，当通以直流电时，载体两性电解质即形成一个从正极到负极连续增加的pH梯度。如果把蛋白质加人此体系中进行电泳时，不同的蛋白质即移动并聚焦于相当其等电点的位置。好的载体两性电解质应具有以下特点：在等电点处有足够的缓冲能力，不易被样品等改变其pH梯度；必须有均匀的足够高的电导，以便使一定的电流通过；分子量不宜太大，便于快速形成梯度并从被分离的高分子物质中除去；不与被分离物质发生化学反应或使之变性等。Ampholine是一种常用的载体两性电解质。要取得满意的等电聚焦电泳分离结果，除有好的载体两性电解质外，还应有抗对流的措施，使已分离的蛋白质区带不致发生再混合。要消除这种现象，办法之一加入抗对流介质，用得最多的抗对流支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。 等电聚焦电泳与其它区带电泳比较具有更高的分辨率，等电点仅差0.01pH的物质即可分开；具有更好的浓缩效应，很稀的样品也可进行分离，并且可直接测出蛋白质的等电点。所以此技术在高分子物质的分离、提纯和鉴定中的应用日益广泛。但是等电聚焦电泳技术要求有稳定的pH梯度和使用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质易发生沉淀。

蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做蛋白质的盐析。原理：蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。

苦逼的医学生 下星期一考生化求人品~

蛋白质分离鉴定的常用方法：u200d沉淀法沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

蛋白质可逆沉淀一般发生在盐析的时候,即在蛋白质溶液中加浓盐溶液,让蛋白质析出,这种情况下蛋白质的空间构象依然完整,复溶后蛋白依然具有生物学活性.蛋白质不可逆沉淀一般认为是蛋白质变性,即蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被破坏,从而导致其生物活性丧失.蛋白质可逆沉淀多用于提取纯化,例如利用盐析法从牛奶中制备酪蛋白.蛋白质不可逆沉淀可用于灭菌,消毒,例如医疗器械高温灭菌.

使蛋白质沉淀的方法：1盐析法，在蛋白质溶液中加入大量的硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等中性盐，破坏蛋白质的水化膜和中和电荷，使蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。2等电点沉淀，等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。3有机溶剂沉淀，有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法称有机溶剂分段沉淀法。常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。4重金属盐沉淀法，其原理是重金属盐可与蛋白质形成不溶于水的蛋白盐沉淀，从达到沉淀蛋白质的目的。5生物碱试剂/酸沉淀，蛋白质又可与生物碱试剂以及某些酸结合成不溶性的盐沉淀，沉淀的条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电荷易于与酸根负离子结合成盐。蛋白质是由α—氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链，再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是构成人体组织器官的支架和主要物质，在人体生命活动中，起着重要作用，可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。每天的饮食中蛋白质主要存在于瘦肉、蛋类、豆类及鱼类中。

（一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解.提取的温度要视有效成份性质而定.一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间.但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作.为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等）. 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择. 1、pH值 蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内.用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液. 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用.同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔.升浓度为宜.缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液. （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必须在低温下操作.丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内（度为10%,40度为6.6%）不会引起酶的变性失活.另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料. 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多,主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶；当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出.盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好.由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀. 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外,一般可在室温中进行.一般温度低蛋白质溶介度降低.但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低,更容易盐析.（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低.（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）.因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%. 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等. 其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升）,在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性.硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节. 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸）,用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行.此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短. 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用. 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行. （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开. 超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质. 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）. （三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开. 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开.值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质. 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素）,当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来.（详见层析技术章） （四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高.这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合.其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离（Separation）,提纯（Purification） 和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用. 细胞的破碎 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度.此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等. 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织. 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施.对超声波敏感和核酸应慎用. 4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎. 5、化学处理法：有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好. 无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取. 浓缩、干燥及保存 一、样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀,为了保存和鉴定的目的,往往需要进行浓缩.常用的浓缩方法的： 1、减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低,减压的真空度愈高,液体沸点降得愈低,蒸发愈快,此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩. 2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液,表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室,用电扇对准吹风,使透过膜外的溶剂不沁蒸发,而达到浓缩目的,此法浓缩速度慢,不适于大量溶液的浓缩. 3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰,盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中,操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体,然后缓慢地融解,利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的.如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时,不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面,蛋白质和酶则集中于下层溶液中,移去上层冰块,可得蛋白质和酶的浓缩液. 4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩.所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应,对生物大分子不吸附,易与溶液分开.常用的吸收剂有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等,使用聚乙二醇吸收剂时,先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里,外加聚乙二醇复盖置于4度下,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积. 5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法,不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留,这是近年来发展起来的新方法,最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐,并具有成本低,操作方便,条件温和,能较好地保持生物大分子的活性,回收率高等优点.应用超滤法关键在于膜的选择,不同类型和规格的膜,水的流速,分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同,必须根据工作需要来选用.另外,超滤装置形式,溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响.Diaflo 超滤膜的分子量截留值： 膜名称分子量截留值孔的大的平均直径 XM－300300,000140 XM－200100,00055 XM－5050,00030 PM－30 30,00022 UM－2020,00018 PM－1010,00015 UM－21,00012 UM05500 10 用上面的超滤膜制成空心的纤维管,将很多根这样的管拢成一束,管的两端与低离子强度的缓冲液相连,使缓冲液不断地在管中流动.然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中.当缓冲液流过纤维管时,则小分子很易透过膜而扩散,大分子则不能.这就是纤维过滤秀析法,由于透析面积增大,因而使透析时间缩短10倍. 二、干燥 生物大分子制备得到产品,为防止变质,易于保存,常需要干燥处理,最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥.真空干燥适用于不耐高温,易于氧化物质的干燥和保存,整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同时增加了温度因素.在相同压力下,水蒸汽压随温度下降而下降,故在低温低压下,冰很易升华为气体.操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体,然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去.此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点,适用于各类生物大分子的干燥保存. 三、贮存 生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系.干燥的制品一般比较稳定,在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化,贮藏要求简单,只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封,保持0－4度冰箱即可,液态贮藏时应注意以下几点. 1、样品不能太稀,必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏,样品太稀易使生物大分子变性. 2、一般需加入防腐剂和稳定剂,常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等.蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性.此外,钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用.核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中. 3、贮藏温度要求低,大多数在0度左右冰箱保存,有的则要求更低,应视不同物质而定.

请查看操作步骤是否正确。溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越溶液沉淀。盐析法是在中药水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达饱和状态，可使某些成分在水中溶解度降低，从而与水溶性大的杂质分离。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。例如自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐析制备。有些成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂提取。 盐析（salting out) 定义 盐析 向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，以破坏蛋白质 的胶体性质，使蛋白质的溶解度降低而从溶液中析出的现 象称为盐析。 如利用盐析法结晶肌红蛋白。 分段盐析 由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同，沉淀时 所需的pH值与离子强度也不相同，改变盐的浓度与溶液 的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开，这种分 离蛋白质的方法称为分段盐析法(fractional salting out)。如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白，饱和硫酸铵 则可沉淀包括血浆清蛋白在内的全部蛋白质。 盐析中常用的中性盐 硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，其中以硫酸铵最为常用。 盐析的原理： 破坏了蛋白质在水中稳定存在的二个因素，从而使蛋白质 发生沉淀 破坏了水化层 在高浓度的中性盐溶液中，由于盐离子亲水性 比蛋白质强，与蛋白质胶粒争夺与水结合，破坏了 蛋白质的水化层。 破坏了电荷 由于盐是强电解质，解离作用强，盐的解离可 抑制蛋白质弱电解质的解离，使蛋白质带电荷减少。 盐析的优点与注意事项 优点 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到 保持生物活性的纯化蛋白质。 注意事项 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度， 溶液pH值越接近蛋白的等电点，蛋白质越溶液沉淀。 盐析的应用---分离蛋白质分子

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

最简单的——加热……吧

蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做蛋白质的盐析。原理：蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。